一对双胞胎脑瘫患儿全基因组测序分析

朱庆文，周 翔，倪玉飞，王 婧，印洪刚，张 勤，卞文君，张玲莉，林孟思，刘江悦，周 君，沙春秀

南通市妇幼保健院(南通大学附属妇幼保健院)产前诊断中心 江苏南通 226006

脑瘫是目前导致我国儿童致残的首位原因[1]。临床上诱发脑瘫的因素很多。由于脑瘫患儿拥有近似的症状，故遗传因素成为脑瘫病因探索的重要方向。已有大量文献[2-3]报道了拷贝数变异(copy number variation, CNV)、脑瘫的易感基因，以及数量较少的家族性遗传性脑瘫的单基因突变的研究。全基因组测序(whole genome sequencing,WGS)技术可以进行CNV、易感基因、单基因突变等分子生物学分析，是很好的疾病遗传学病因分析工具。我们对一对胞胎脑瘫患儿进行了WGS分析，测序数据比对参考了人类参考基因组(version: NCBI Build37/hg19)。现将研究结果报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料双胞胎脑瘫患儿来自于当地，于2016年2月来我院进行儿童康复训练，属于异卵双胞胎，均为男性，年龄2岁。临床症状：两例患儿发育迟缓，运动功能不协调，智商落后于正常同龄儿童，存在认知与言语障碍。参照2014年中华实用儿科临床杂志制定的脑性瘫痪的定义、诊断条件和分型标准[4]，两例被临床分型为混合型和肌张力低下型脑瘫。混合型脑瘫患儿MR影像可见：两侧脑室及第三脑室扩张，两侧额颞部颅板下见弧形液性信号影；胼胝体偏薄，脑沟脑池正常，脑中线结构居中，右侧乳突气房内见高信号。肌张力低下型患儿MR影像可见：双侧侧脑室周围见少许斑片状长T1长T2异常信号，脑白质少，胼胝体较薄，两侧脑室扩张，形态欠规则，脑中线结构居中。

患儿父母查体未见异常，常见遗传代谢性疾病如苯丙酮尿症、糖或氨基酸代谢异常等疾病的筛查试验均正常，否认产伤史，否认病毒、细菌感染用药史，否认毒物、放射性物质、宠物接触史，否认糖尿病等病史。本研究获患儿家属知情并签署知情同意书。

1.2WGS检测方法和数据分析委托药明康德公司对两例患儿样本进行双端150 bpWGS检测(Hiseq X Ten测序仪，美国Illumina公司)。生物信息学分析由苏州贝康生物公司协助完成，遗传学分析由本科室生物信息以及遗传分析人员进行。双胞胎父母CNV验证试验采用基因芯片法，由本科室实验人员采用昂飞750K芯片进行检测。

2 结果

2.1数据质量评估Hiseq X Ten平台测序数据有效利用率大于90%，Q30≥80%，说明碱基质量稳定，能够保证后续分析的正常进行。测序数据碱基分布评估结果显示，不存在AT、 GC分离现象，测序数据符合实验要求。2例标本的测序深度主要集中于20X(85.89%和82.49%)；除Y染色体覆盖度较低外，大多数染色体覆盖度在90%以上。各条染色体上的测序深度以及覆盖度见图1。

2.2变异检测结果SNP、InDel和CNV检测结果

见表1～3。对检测到的SNP和INDEL进行如下过滤：去除人群数据库中突变频率过高(AF>0.05)的变异，去除ClinVar数据库注释为良性或疑似良性的变异，去除突变碱基深度过低(AO<5)的变异，去除位于内含子和基因间区的变异，去除同义突变，去除本地外显子数据库中突变频率过高(AF>0.05)的变异。对所有共有突变进行脑瘫相关基因的筛选，主要与Genetics Home Reference数据库比对，共检索到与两例相关的30个基因(表4)。共有7个基因(CD59、FOLR1、 KANK1、MEF2C、PRKCH、ROBO3、SLC25A12)为两例患儿共有突变(表5)。在7个基因中，只在KANK1的外显子区域发现了一个两例共有的突变： NM_153186:c.1517C>T，是错义突变。经数据库检索及分析，我们认为该突变致病的可能性相对较小，属于临床意义不明的变异位点。

2.3患儿父母CNV验证结果对患儿父母进行基因芯片检测，结果(图2)显示：患儿母亲在14号染色体同样有一个缺失，大约543 kb，涉及TRA和TRD两个基因；两个患儿该突变应是遗传母方；查询NCBI、Genetics Home Reference、OMIM数据库，TRA和TRD属于蛋白质编码基因，与T细胞受体α/β缺乏等疾病相关联，与脑瘫关联不大。患儿2号染色体存在120 kb重复,父母双方此重复均较小(未达到芯片检测重复>500 kb的标准)，同时该片段上的基因LINC01813属于ncRNA，与脑瘫关联亦不大。

表1 外显子区域中不同类型SNP数目

表2 外显子区域不同类型InDel数目

表3 共有的CNV检测结果

表4 30个与病例相关的脑瘫基因

表5 位于已知脑瘫相关基因上的共有突变

A：父亲；B：母亲

3 讨论

在大量脑瘫原因分析的文献中，由于着重点集中在CNV、易感基因的检测、家族性遗传性脑瘫的单基因突变的致病基因等单项研究上[2-3]，对患儿其他遗传因素的筛选，难免有遗漏的可能性存在。两例脑瘫患儿都具有积水表现，临床分型分别为混合型和肌张力低下型，临床症状有轻重之别。双胞胎患儿遗传背景相似，发生脑瘫的外部因素近似，由此通过WGS分析找到脑瘫发生的共同的遗传因素的概率较大，对这些共同的遗传因素扩大病例筛选，有可能获得脑瘫发生的遗传标志物。在本研究中，我们首先排除了一些有与脑瘫相近似症状的罕见遗传病，如罕见神经系统肌肉疾病(佩梅病、肌张力障碍及其相关基因的疾病等)、代谢紊乱相关疾病(嘌呤/嘧啶代谢异常、丙酮酸脱氢酶缺乏症、血浆肌酸和胍乙酸异常、3-羟基丁酸酯缺乏、葡萄糖转运子1缺乏等综合征)、Cockayne综合征等罕见的常染色体隐性遗传疾病[5-9]。同时对CNV、SNP、InDel等变异进行了全基因组的检测，并不局限于单个基因突变以及部分易感基因的检测。

WGS获得的数据量巨大，变异数据也是海量的。经详细分析比对，本研究共发现30个与脑瘫有关联的基因，如人类转录激活因子蛋白4(adaptor protein complex-4, AP4)、GAD1、ADD3等；在KANK1的外显子区域发现一个共有SNP突变(NM_153186:c.1517C>T)，为错义突变；CNV分析中，chr2上有大约120 kb的重复，chr14上有大约280 kb和540 kb的缺失，基因芯片验证试验证实，该缺失来自于母亲。两个患儿有7个共有的涉及脑瘫的基因突变；即使是双胞胎，也有23个脑瘫关联基因是并不为两个患儿所共有，涉及胎儿脑部生长发育、遗传性脑瘫、智障血栓等基因；说明两例患儿脑瘫发生机制可能并不相同，造成两例患儿的遗传表型特征不一致，这可能是两例患儿临床特征不一致的原因。上述发现也说明，虽然一些胎儿在脑瘫前未发生缺氧缺血事件，但出生后仍发生脑瘫，表现出更易发病的倾向[10]，有其遗传基础。

AP4属于已知的遗传性脑瘫高发相关基因，包含4个亚基，AP4B1、AP4S1、AP4M1 和AP4E1，其中任何一个亚基异常都会导致AP4 复合物的功能障碍，可能会导致儿童脑瘫的发生[11]。同时AP4 介导转运的蛋白质分子AMPA一旦受到影响，AMPA受体介导的谷氨酸兴奋性毒性会参与缺氧缺血性脑白质损伤的发生[12]。在中国汉族人群中，AP4B1 与伴有缺血缺氧性脑病脑瘫患儿的关系最为密切[13]。GAD1 基因突变会影响脑脊液中谷氨酸与GABA 浓度失衡，从而影响脑细胞的发育[14]。ADD3 基因编码内收蛋白的γ亚基，其与α、β等亚基构成的异源二聚体或异源四聚体与肌动蛋白、血影蛋白复合体结合，可以影响骨架蛋白的稳定性，导致成纤维母细胞异常分化和移行，进而发生脑瘫[15-16]。7个共有脑瘫相关基因突变中, KANK1是惟一的外显子区域的突变。查询 OMIM、NCBI数据库(CPSQ2; 612900)、(OMIM: 607704)，只能检索到一个与KANK1外显子区域突变有关的记录，且记录的突变类型为缺失，不是点突变；在其他相关数据库中未检索到该点突变影响脑瘫发生的报道。因此该突变致病的可能性相对较小[17]，按照ACMGD分类原则，可将其定义为临床意义不明的突变。KANK1 基因编码的蛋白为细胞骨架相互作用蛋白，可能作用于发育中的大脑[18]。CD59基因与血栓有关，其编码的CD59蛋白是一种补体调节蛋白，对细胞凋亡、组织损伤造成的局部血管栓塞有重要的调控作用，但作为脑瘫高危基因，还很罕见报道。常见文献报道的血栓易感基因有遗传性血栓因子V 的Leiden(FV G1691A)、C 或S 蛋白和抗凝血酶Ⅲ、高同型半胱氨酸血症、亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)和凝血酶原基因等[19-20]。但也有文献[21]报道FV G1691A、MTHFR 和凝血素G20210A 等基因与罹患脑瘫无明显关联。本研究未发现上述基因异常，因此上述血栓易感基因对脑瘫的发生是否有影响还不能完全证实。其他5个共有基因突变与脑瘫的关系还需要继续累积数据，才能从遗传学上给予判断。

WGS检测的视野是全景的，因此，本研究还可以与部分文献的结论进行对比。有研究[22]认为ApoE 基因中的ApoEε2、ApoEε3 在脑损伤中起保护作用，ApoEε4 与脑瘫的严重程度密切相关；也有作者[23-24]认为在中国人群中ApoE 基因多态性可能是脑瘫发病的一个潜在危险因素，但并没有发现ApoEε4 与脑瘫的相关性。我们未在两例双胞胎中检测到ApoE 基因的异常。一些与东亚人群脑瘫相关的易感基因，如骨调素基因(OPN)[25]、Ⅳ型胶原基因A1(COL4A1)[26]、肿瘤坏死因子-肿瘤坏死因子4A1[27]等，也没有在双胞胎中检测到。这些结果也说明，家族性遗传性脑瘫单基因突变检测在分析脑瘫致病遗传因素方面有明显的局限性。

在本研究中，我们还检测到了CNV，分别为2号染色体上大约120 kb的重复，14号染色体上大约280 kb和540 kb的缺失，经与NCBI、Genetics Home Reference、OMIM数据库的比对，结果显示：在数据库中2号染色体上的重复区间均小于500 kb,因此其临床意义属于可能良性和意义不明；14号染色体上的缺失的临床意义不明，其致病可能性不确定。采用基因芯片检测其父母，并没有检测到相关重复，只在母亲14号染色体发现了547 kb的缺失，证实该缺失遗传于母亲，但重复和缺失包含的基因对脑瘫遗传贡献不大。有文献[28]报道了CNV拷贝数变异，但本研究例数较少，比较的意义不大。

综上所述，我们认为脑瘫的致病因素表现出复杂的遗传倾向性，脑瘫可能是由多个基因诱发的，易感基因检测、遗传性脑瘫的单基因突变研究仍然是脑瘫致病因素探索的主要方向。