血清PGⅠ、PGⅡ、miRNA-21、let- 7 a检测对胃癌的诊断价值

刘红军

濮阳市中医医院检验科，河南濮阳457000

近年来，胃癌的发病率和病死率均有所下降，然而胃癌仍然是发展中国家肿瘤相关死亡的主要原因[1]。尽管晚期胃癌的诊断和治疗取得了一定进展，但胃癌患者的预后仍较差，主要原因是早期诊断率低。胃癌早期诊断的生物标志物包括癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）、糖类抗原19-9（carbohydrate antigen 19-9，CA19-9）及糖类抗原125（carbohydrate antigen 125，CA125），单独检测时诊断胃癌的灵敏度和特异度均较低[2]。研究证实，胃蛋白酶原（pepsinogen，PG）Ⅰ、PGⅡ在胃癌的诊断中具有较高的应用价值[3]。微小RNA（microRNA，miRNA）作为癌基因或抑癌基因，在肿瘤的发生、发展过程中具有重要的调控作用。研究表明，miRNA在人类血浆中稳定表达且可检测，其在正常组织和肿瘤组织中的差异性表达存在组织特异性[4]。let-7a是较早被发现的let-7家族主要成员之一，能够通过作用于p53、c-myc等靶基因，调控肿瘤细胞的增殖、迁移、侵袭和凋亡，与肿瘤的转移及预后密切相关。本研究探讨了血清PGⅠ、PGⅡ、miRNA-21、let-7a检测对胃癌的诊断价值，现报道如下。

1 对象与方法

1.1 研究对象

选择2014年1月至2016年6月于濮阳市中医医院治疗的75例胃癌患者作为研究组。纳入标准：①经术后病理证实为胃癌，符合国际抗癌联盟（Union for International Cancer Control，UICC）第 7版TNM分期标准；②术前未进行放化疗治疗。排除标准：合并免疫系统、血液系统、内分泌系统疾病。研究组中，男41例，女34例；年龄46～81岁，平均（52.61±8.3）岁；TNM分期：Ⅰ期36例，Ⅱ期12例，Ⅲ期17例，Ⅳ期10例。选取同期健康体检者60例作为对照组，男32例，女28例；年龄44～79岁，平均（51.23±7.9）岁。两组受试者的性别和年龄比较，差异均无统计学意义（P﹥0.05），具有可比性。本研究经濮阳市中医院医学伦理委员会审批通过，所有受试者均对本研究知情并签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 标本采集采集所有受试者的清晨空腹外周静脉血5 ml，置于乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）抗凝管中，3000 r/min离心10 min后，分离血清，于-20℃冰箱中保存。

1.2.2 血清PGⅠ、PGⅡ检测采用美国贝克曼DXI800 Access全自动化学发光分析仪进行血清PGⅠ、PGⅡ测定，严格按照说明书进行操作。

1.2.3 miRNA-21、let- 7 a半定量检测采用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应（quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction，qRT-PCR）检测受试者的血清miRNA-21和let-7a表达水平。应用RNA提取试剂盒（购自美国sigma-aldrich公司）提取血清总RNA，采用反转录试剂盒（购自日本Takara公司）将纯化的RNA逆转录合成cDNA，以cDNA作为模板进行qRT-PCR。采用ABI 7500 Fast Real-Time PCR系统，分别扩增miRNA-21、let-7a和内参照U6 snRNA，引物均由上海生工生物工程有限公司合成。每个反应设3个重复。qRT-PCR反应条件：95℃30 s（预变性）；95℃15 s，60℃15 s，72℃30 s，共40个循环。扩增结束后确认扩增曲线和溶解曲线，保证得出数据的可靠性。应用2-ΔΔCt法计算miRNA-21、let-7a的相对表达水平。

1.3 统计学方法

采用SPSS 20.0软件对数据进行统计分析。计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用t检验或方差分析。采用Logistic回归模型分析早期胃癌发生的影响因素。应用受试者工作特征（receiver operator characteristic，ROC）曲线及曲线下面积（area under the curve，AUC）评估各血清学指标对胃癌的诊断价值。以P﹤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 血清PGⅠ、PGⅡ、miRNA-21、let- 7 a水平的比较

两组受试者的血清PGⅡ水平比较，差异无统计学意义（P﹥0.05）。研究组的血清PGⅠ、let-7a水平及PGⅠ/PGⅡ均明显低于对照组，血清miRNA-21水平明显高于对照组，差异均有统计学意义（P﹤0.01）。（表1）

2.2 不同TNM分期胃癌患者血清PGⅠ、PGⅡ、miRNA--21、let-7a水平的比

表1 两组受试者血清PGⅠ、PGⅡ、miRNA-21、let- 7 a水平的比较（± s）

表1 两组受试者血清PGⅠ、PGⅡ、miRNA-21、let- 7 a水平的比较（± s）

组别研究组（n=75）对照组（n=60）t值P值PGⅠ（ng/ml）49.44±4.41 105.17±7.71 52.761 0.000 PGⅡ（ng/ml）12.53±2.57 11.83±2.96 1.470 0.144 PGⅠ/PGⅡ3.96±0.67 8.92±1.03 33.739 0.000 miRNA-21 1.83±0.23 0.85±0.14 28.976 0.000 let-7a 0.84±0.06 1.25±0.09 31.643 0.000

不同TNM分期胃癌患者的血清PGⅠ、miRNA-21水平和PGⅠ/PGⅡ比较，差异均有统计学意义（P﹤0.01）。不同TNM分期胃癌患者的血清PGⅡ及let-7a水平比较，差异均无统计学意义（P﹥0.05）。（表2）

2.3 血清PGⅠ、PGⅠ/PGⅡ、miRNA-21、let-7a检测对胃癌的诊断效能

表2 不同TNM分期胃癌患者血清PGⅠ、PGⅡ、miRNA-21、let- 7 a水平的比较（ n=75，± s）

表2 不同TNM分期胃癌患者血清PGⅠ、PGⅡ、miRNA-21、let- 7 a水平的比较（ n=75，± s）

TNM分期Ⅰ（n=36）Ⅱ（n=12）Ⅲ（n=17）Ⅳ（n=10）F值P值PGⅠ（ng/ml）53.26±4.18 49.06±3.91 45.22±3.20 43.37±5.12 24.043 0.000 PGⅡ（ng/ml）12.53±3.01 12.34±2.74 12.41±2.69 13.06±1.83 0.151 0.929 PGⅠ/PGⅡ4.23±0.71 4.01±0.62 3.71±0.69 3.38±0.65 5.033 0.003 miRNA-21 1.43±0.12 1.59±0.16 2.36±0.22 2.70±0.26 205.114 0.000 let-7a 0.85±0.07 0.84±0.05 0.83±0.08 0.81±0.06 1.002 0.397

PGⅠ诊断胃癌的AUC为0.884，约登指数为0.580，临界值为70.08 ng/ml，灵敏度为85.41%，特异度为74.26%。PGⅠ/PGⅡ诊断胃癌的AUC为0.786，约登指数为0.547，临界值为4.13，灵敏度为89.32%，特异度为65.33%。miRNA-21诊断胃癌的AUC为0.803，约登指数为0.623，临界值为1.16，灵敏度为77.03%，特异度为85.25%。let-7a诊断胃癌AUC为0.805，约登指数为0.627，临界值为1.12，灵敏度为90.54%，特异度为72.13%。其中PGⅠ对胃癌的诊断效能最高。（图1）

2.4 血清PGⅠ、PGⅠ/PGⅡ、miRNA-21、let-7a及PGⅠ联合miRNA-21检测对早期（Ⅰ～Ⅱ期）胃癌的诊断效能

图1 血清PGⅠ、PGⅠ/PGⅡ、miRNA-21、let- 7 a诊断胃癌的ROC曲线

PGⅠ、PGⅠ/PGⅡ、miRNA-21、let-7a及PGⅠ联合miRNA-21诊断早期胃癌的AUC分别为0.883、0.782、0.776、0.780、0.904，其中PGⅠ联合miRNA-21检测对早期胃癌的诊断效能最高。（图2、表3）

2.5 早期胃癌发生影响因素的多因素分析

图2 血清PGⅠ、PGⅠ/PGⅡ、miRNA-21、let- 7 a及PGⅠ联合miRNA-21诊断早期胃癌的ROC曲线

表3 血清PGⅠ、PGⅠ/PGⅡ、miRNA-21、let- 7 a及PGⅠ联合miRNA-21检测对早期胃癌的诊断效能

Logistic多因素分析结果显示，血清PGⅠ和miRNA-21是早期胃癌发生的独立影响因素（OR=1.53、1.43、P﹤0.05）。（表4）

3 讨论

表4 早期胃癌发生影响因素的多因素分析

PG是胃黏膜特异性功能酶——胃蛋白酶的无活性前体，是临床检测胃部疾病的生物标志物。PG可分为两种生化和免疫活性不同的亚群：PGⅠ主要由胃底腺细胞分泌，其表达水平变化与胃泌酸腺细胞的功能及胃黏膜腺体的萎缩有关；PGⅡ主要由幽门腺、贲门腺分泌，其表达水平的变化可以反映胃底黏膜病变情况。PGⅠ/PGⅡ下降直接反映胃黏膜萎缩进展[5]。由于分泌PGⅡ的细胞分布较广，胃癌患者的血清PGⅡ水平变化不明显，因此，通常采用PGⅠ/PGⅡ评估PG的变化情况，PGⅠ和PGⅠ/PGⅡ联合检测可发挥胃底腺黏膜“血清学活检”的作用。Kalinovskiĭ等[6]研究报道，萎缩性胃炎和胃癌患者的血清PGⅠ水平明显低于健康者，且低分化胃癌患者的血清PGⅠ水平明显低于高分化胃癌患者。Miki[7]的研究证实，血清PGⅠ水平和PGⅠ/PGⅡ降低对胃癌的早期诊断具有重要意义。PG不是真正意义上的肿瘤标志物，但其表达水平的变化可以反映胃黏膜的萎缩程度，而萎缩性胃炎是胃癌的癌前病变，PG检测可筛查出需要做胃镜检查的高危人群，因此，血清PG水平变化常作为胃癌前兆的亚临床指标。本研究发现，胃癌患者的血清PGⅠ水平和PGⅠ/PGⅡ均明显低于健康体检者（P﹤0.01），与上述研究报道结果一致。另外，各地文献报道的PG诊断胃癌及萎缩性胃炎的临界值不同，导致其诊断的灵敏度和特异度存在差异[8-9]，这可能与检测方法不同有关，同样也受病变程度和部位及病理分级不同的影响。本研究结果显示，血清PGⅠ诊断胃癌的AUC为0.884，最佳临界值为70.08 ng/ml，灵敏度和特异度分别为85.41%、74.26%；血清PGⅠ/PGⅡ诊断胃癌的AUC为0.786，最佳临界值为4.13，灵敏度和特异度分别为89.32%、65.33%。王雪华等[10]以PGⅠ74 ng/ml为最佳临界值，发现其诊断胃癌的灵敏度和特异度分别为85.7%、75.0%，以PGⅠ/PGⅡ4为最佳临界值，其诊断胃癌的灵敏度和特异度分别为89.0%、62.5%，与本研究结果略有不同，其原因可能与检测方法不同有关。另有研究发现，血清PGⅠ、PGⅡ水平与性别、年龄及幽门螺杆菌感染等因素均有关[11]。因此，临床上通常应用PG检测联合其他生物学指标诊断胃癌。

miRNA是长度为21～25个核苷酸的非编码RNA，其通过靶向结合mRNA的3'非翻译区（3'UTR）抑制转录和转录后水平的基因表达。miRNA与肿瘤的发生及发展密切相关，在胃液、血浆和血清中的表达水平较为稳定，且在细胞信号转导通路中具有重要作用，发挥致癌基因或抑癌基因的功能，因此在肿瘤的诊断中具有潜在价值。基于芯片技术和生物信息学方法的研究发现了大量与胃癌有关的miRNA，其中，miRNA-21是发现较早、存在较为广泛的miRNA，能够通过作用于Bcl-2、PTEN、caspase 3等多个靶基因，在多种肿瘤中发挥致癌基因的作用[12]。彭宝莹等[13]研究发现，miRNA-21在胃癌组织中的表达水平明显高于癌旁正常组织，提示miRNA-21可作为诊断胃癌的有效指标。Cui等[14]研究发现，胃液中的miRNA-21可作为诊断胃癌的潜在生物标志物，具有较高的诊断价值。胡煊等[15]研究表明，胃癌患者血液中miRNA-21的表达水平明显高于健康体检者，且与肿瘤浸润深度、TNM分期、淋巴结转移等临床特征有关。本研究结果显示，胃癌患者血清miRNA-21水平明显高于健康体检者（P﹤0.01）；不同TNM分期胃癌患者的血清miRNA-21水平比较，差异有统计学意义（P﹤0.01）。研究表明，let-7a在多种肿瘤组织中的表达下调，是公认的具有抑癌作用的miRNA[16]。Zhang等[17]研究发现，let-7a在胃癌组织中的表达水平明显低于癌旁正常组织。Tsujiura等[18]研究发现，胃癌患者血清和肿瘤组织中均可检测到let-7a的表达，且其在胃癌组织中的表达水平明显低于癌旁正常组织，而胃癌患者的血清let-7a表达水平明显低于健康体检者。上述研究表明，let-7a可作为诊断胃癌的肿瘤标志物。本研究结果发现，胃癌患者的血清let-7a水平明显低于健康体检者（P﹤0.01），在胃癌中可能作为抑制基因发挥调控作用。

本研究分析血清miRNA-21及let-7a检测对胃癌的诊断效能，结果发现，血清miRNA-21诊断胃癌的AUC为0.803，灵敏度和特异度分别为77.03%、85.25%；血清let-7a诊断胃癌的AUC为0.805，灵敏度和特异度分别为90.54%、72.13%。结果提示，血清miRNA-21和let-7a诊断胃癌均有较高的应用价值，且miRNA-21的特异度较高，而let-7a的灵敏度较高。本研究结果还显示，不同TNM分期胃癌患者的血清PGⅠ水平和PGⅠ/PGⅡ比较，差异均有统计学意义（P﹤0.01）。PGⅠ、PGⅠ/PGⅡ、miRNA-21、let-7a以及PGⅠ联合miRNA-21诊断早期（Ⅰ～Ⅱ期）胃癌的AUC分别为0.883、0.782、0.776、0.780和0.904，其中PGⅠ联合miRNA-21检测的诊断效能最高。Logistic回归分析结果显示，血清PGⅠ和miRNA-21是早期胃癌发生的独立影响因素（OR=1.53、1.43，P﹤0.05）。

综上所述，PGⅠ、PGⅡ、miRNA-21、let-7a等生物标志物在胃癌患者的血清中异常表达，PGⅠ对早期胃癌的诊断效能较高，其与血清miRNA-21联合检测可提高早期胃癌的诊断效能。