PI3K/AKT信号通路相关蛋白表达与食管癌淋巴结转移的关系△

张小三，张一鸣，赵燕，戚春晖，杨树军#

1郑州大学附属肿瘤医院/河南省肿瘤医院内科，郑州 450008

2郑州第七人民医院儿科，郑州 450006 00

食管癌是消化系统常见的恶性肿瘤，预后较差，转移较早，早期症状不明显，大部分患者就诊时已出现了淋巴结转移[1]，因此，探究早预防、早发现、早治疗的方法成为食管癌相关科研工作中需要不断探索的课题。研究表明，磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，PKB，也称AKT）信号转导通路能够通过影响下游多种分子的活化状态而对肿瘤细胞的增殖和凋亡进行调节[2]。也有研究报道称PI3K/AKT信号通路与肿瘤微淋巴管的形成和淋巴结转移密切相关[3]。但是，关于PI3K/AKT信号通路相关蛋白在食管癌组织中的表达情况与淋巴结转移关系的相关研究目前尚未见报道。微淋巴管密度（lymphatic microvessel density，LMVD）指的是单位视野中微淋巴管的数量。有研究显示，在胃癌组织中，LMVD是淋巴结转移的重要因素，即LMVD的增加有利于胃癌的淋巴结转移，分析其原因可能是因为微淋巴管数量的增加使肿瘤和淋巴管内皮接触的面积增大，从而促使肿瘤细胞更容易进入淋巴管发生淋巴结转移[4]。本研究通过免疫组织化学法检测PI3K和AKT蛋白在食管癌组织中的表达情况，并分析PI3K和AKT蛋白表达与食管癌患者临床特征以及LMVD的关系，现报道如下。

1 对象与方法

1.1 研究对象

选取2017年4月至2018年2月郑州大学附属肿瘤医院/河南省肿瘤医院收治的术后经病理学检查证实为食管癌的120例患者的组织标本。纳入标准：①经病理组织学检查证实为食管癌；②术前未行靶向治疗、放疗、化疗或者免疫治疗。排除标准：①合并严重的心、肺疾病；②术前行新辅助放化疗、靶向治疗。120例食管癌患者中，男70例，女50例；年龄40～79岁，平均年龄为（48.87±9.45）岁；按照国际抗癌联盟TNM分期第8版[5]：Ⅰ+Ⅱ期64例，Ⅲ+Ⅳ期56例；组织分化程度：高分化40例，中分化50例，低分化30例；有淋巴结转移68例，无淋巴结转移52例。同时收集上述患者癌旁（距肿瘤边缘﹥2 cm）经病理学检查证实的120例食管正常黏膜组织标本作为对照。患者及家属均对本研究知情同意并签署知情同意书，本研究经过医院医学伦理委员会审查通过。

1.2 主要抗体和试剂盒

兔抗人PI3K多克隆抗体、兔抗人AKT多克隆抗体、D2-40单克隆抗体均购自北京奥维亚生物技术有限公司，二氨基联苯胺（diaminobenzidine，DAB）显色试剂盒、免疫组织化学试剂盒均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.3 免疫组织化学染色方法

对所有组织标本采用10%中性福尔马林溶液固定，常规取材，石蜡包埋。后将蜡块进行切片，置入40%的乙醇中，然后置于40℃水浴锅中水浴4 min，进行展开，然后置于60℃烘箱内烘干。采用二甲苯脱蜡20 min，然后采用梯度乙醇进行水化，对PI3K、AKT、D2-40蛋白进行高温高压组织修复，然后加入3%过氧化氢溶液，室温下孵育10 min，以阻断内源性过氧化物酶的活性。磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）进行冲洗，加入5%羊血孵育30 min，除去封闭液，加入一抗，置于4℃冰箱过夜，PBS冲洗，DAB显色，然后使用PBS冲洗终止显色，使用自来水冲洗，盐酸乙醇分化，乙醇脱水干燥。对PI3K和AKT蛋白表达情况进行判定。

1.4 判定标准

1.4.1 PI 3 K和AKT阳性判定标准[6]PI3K和AKT蛋白均表达于细胞质，阳性染色结果表现为细胞内出现棕黄色颗粒。采用染色强度和阳性细胞所占百分比两项评分总分判定PI3K和AKT蛋白是否阳性表达。依据染色强度评分：无着色为0分，浅黄色为1分，棕黄色为2分，黄褐色为3分。依据阳性细胞所占百分比评分：阳性细胞﹤10%记为0分；阳性细胞所占百分比为10%～20%记为1分；阳性细胞所占百分比为21%～50%记为2分；阳性细胞所占百分比﹥50%记为3分。最终得分为染色强度和阳性细胞所占百分比评分之和，﹥2分为阳性表达，≤2分为阴性表达。

1.4.2 LMVD计数标准[7]D2-40表达定位于淋巴管内皮细胞，呈棕黄色或棕褐色颗粒，先在低倍镜下选取微淋巴管染色丰富的区域，然后在高倍镜下每个区域中选取5个视野（每个视野0.16 mm2）分别计算微淋巴管数目，取平均值作为LMVD。含有平滑肌或﹥8个内皮细胞的管腔及未染色的管腔均不记数。

1.5 统计学方法

采用SPSS 16.0软件对数据进行统计分析。计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用t检验；计数资料以例数和率（%）表示，组间比较采用χ2检验。以P﹤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同组织中PI 3 K和AKT蛋白表达情况的比较

食管癌组织中PI3K和AKT蛋白的阳性表达率分别为85.0%（102/120）和86.7%（104/120），均明显高于癌旁食管正常黏膜组织中的4.2%（5/120）和5.8%（7/120），差异均有统计学意义（χ2=158.679、157.704，P﹤0.01）。（表1、图1）

表1 食管癌组织和癌旁食管正常黏膜组织中PI 3 K和AKT蛋白的表达情况[ n（%）]

图1 PI 3 K和AKT在食管癌组织和癌旁食管正常黏膜组织中的表达情况（免疫组化染色，×200）

2.2 食管癌组织中PI 3 K和AKT蛋白表达情况与食管癌患者临床特征的关系

不同性别、组织分化程度食管癌患者食管癌组织中PI3K、AKT蛋白的阳性表达率比较，差异均无统计学意义（P﹥0.05）；有淋巴结转移、TNM分期为Ⅲ+Ⅳ期食管癌患者的食管癌组织中PI3K蛋白的阳性表达率均明显高于无淋巴转移、TNM分期为Ⅰ+Ⅱ期的食管癌患者，差异均有统计学意义（χ2=10.232、10.756，P﹤0.01）。有淋巴结转移、TNM分期为Ⅲ+Ⅳ期的食管癌患者食管癌组织中AKT蛋白的阳性表达率均高于无淋巴转移、TNM分期为Ⅰ+Ⅱ期的食管癌患者，差异均有统计学意义（χ2=10.809、5.781，P﹤0.05）。（表2）

2.3 食管癌组织中LMVD与PI 3 K、AKT蛋白表达的关系

PI3K蛋白阳性表达食管癌组织中LMVD为（13.92±3.02），明显高于PI3K蛋白阴性表达食管癌组织的（6.54±1.05），差异有统计学意义（t=10.228，P﹤0.01）；AKT蛋白阳性表达食管癌组织中LMVD的数量为（13.84±3.08），明显高于AKT蛋白阴性表达食管癌组织的（6.14±0.89），差异有统计学意义（t=9.904，P﹤0.01）。

表2 不同临床特征食管癌患者食管癌组织中PI 3 K、AKT蛋白的阳性表达情况（ n=120）

3 讨论

作为世界上高发的恶性肿瘤之一，食管癌在中国肿瘤发病率中排名第5位，病死率中排名第4位，随着人们生活节奏的不断加快，饮食不规律的现象逐渐增多，因此，食管癌的发病率也呈逐年增加态势。并且，因早期食管癌的临床症状不明显，患者往往于就诊时已出现淋巴结转移，大大增加了患者的病死率[8]。

PI3K是一种胞内的磷脂酰肌醇激酶，参与多种生长因子的活化；AKT作为一种丝氨酸/苏氨酸激酶，能够直接对多种转录因子进行磷酸化，从而参与生命活动的调节进程[9]。研究表明，PI3K/AKT信号通路不仅参与肿瘤细胞增殖和凋亡的调节，还与肿瘤微淋巴管的生成和侵袭密切相关[10]，目前已经成为了肿瘤靶向治疗研究的热点。相关研究发现，PI3K在乳腺癌组织中的阳性表达率高于癌旁组织，且PI3K的表达与TNM分期、肿瘤大小密切相关，而与患者的年龄无关[9]。Yamamoto等[11]研究发现，在肝癌细胞中，PI3K/AKT信号通路激活抑制了细胞周期蛋白的降解，促进了G0期细胞进入DNA合成期（S期），从而促进了肝癌细胞的异常增殖。本研究采用免疫组织化学法检测食管癌和癌旁正常黏膜组织中PI3K和AKT蛋白的表达情况，结果显示，食管癌组织中PI3K和AKT蛋白的阳性表达率均明显高于癌旁食管正常黏膜组织（P﹤0.01），提示PI3K/AKT信号通路在食管癌的发生过程中起着重要的作用。

有研究表明，PI3K/AKT信号通路能够直接或间接地促进肿瘤新生血管的生成，在恶性肿瘤转移的进程中发挥着极其重要的作用[12]。也有研究认为PI3K/AKT信号通路参与了淋巴管的生成，从而参与了肿瘤淋巴结的转移进程[13]。本研究发现，PI3K/AKT信号通路相关蛋白阳性表达食管癌组织中的LMVD分别高于PI3K/AKT信号通路相关蛋白阴性表达食管癌组织，推测PI3K/AKT信号通路相关蛋白在食管癌淋巴管的生成方面可能起着关键作用；同时研究还发现有淋巴结转移食管癌患者食管癌组织中的PI3K/AKT信号通路相关蛋白阳性表达率均高于无淋巴结转移的食管癌患者（P﹤0.05），TNM分期为Ⅲ+Ⅳ期食管癌组织中的PI3K/AKT信号通路相关蛋白阳性表达率均高于TNM分期为Ⅰ+Ⅱ期的食管癌患者（P﹤0.05），推测PI3K/AKT信号通路相关蛋白在促进食管癌的淋巴结转移方面也起着至关重要的作用。

综上所述，PI3K/AKT信号通路相关蛋白在食管癌发生和淋巴结转移过程中均起着至关重要的作用，阻断该信号通路的某一环节，可能成为食管癌的新的治疗靶点。