膀胱癌组织MFN 2、Bmi- 1蛋白表达及临床意义分析

韩志兴，赵玉千，刘庆军，纪世琪，张海建

首都医科大学附属北京地坛医院泌尿外科，北京100015 0

流行病学研究表明，中国部分地区膀胱癌的发病率具有明显上升趋势[1]。临床上膀胱癌的发生，能够导致患者总体生活水平下降[2-3]。在探讨膀胱癌病情进展的相关生物学机制的过程中，可以发现不同的细胞因子的改变，能够通过影响信号通路的激活干预肿瘤细胞的能量代谢等过程，进而促进膀胱癌的病情进展。线粒体融合蛋白2（mitofusion 2，MFN2）的表达上调，能够促进线粒体膜的融合，抑制肿瘤细胞的能量合成和代谢，进而抑制上皮细胞的增殖，促进上皮细胞的凋亡[4]；Bmi-1是多巯基家族相关成员，其能够通过影响肿瘤细胞的细胞核DNA末端端粒结构的稳定性，促进肿瘤细胞持续性增殖，并能够引起肿瘤细胞的分化障碍[5]。为了进一步揭示MFN2、Bmi-1表达与膀胱癌的关系，从而为临床上膀胱癌患者的诊疗提供理论基础，本研究选取了80例膀胱癌组织，探讨MFN2、Bmi-1在膀胱癌患者病灶组织中的表达情况，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料选取

选取2015年1月至2018年1月在首都医科大学附属北京地坛医院保存的膀胱癌组织标本。纳入标准：①均经病理学检查确诊为膀胱癌；②术前未行放化疗等抗肿瘤治疗；③临床资料保存完整。排除标准：合并有其他恶性肿瘤。根据纳入、排除标准，共选取膀胱癌组织80例，另选取正常膀胱组织80例作对照。80例膀胱癌组织所属患者中，男53例，女27例；年龄为45～78岁，平均年龄为（60.21±8.91）岁。80例正常膀胱组织所属患者中，男50例，女30例；年龄为43～79岁，平均年龄为（59.41±10.32）岁。两组患者的性别、年龄比较，差异均无统计学意义（P﹥0.05），具有可比性。

1.2 免疫组化检测方法

采用石蜡进行连续性切片，脱蜡至水后采用H2O2室温下孵育10 min。磷酸盐缓冲液冲洗3次，每次3～5 min。8%的蛋白粉封闭液（购自南京碧云天生物科技公司），封闭2 h。弃封闭液后加入一抗（兔来源一抗浓度1∶1000，4℃冰箱过夜，磷酸盐缓冲液冲洗3次，每次3～5 min；加入二抗（鼠来源二抗浓度1∶400），室温孵育20～30 min。磷酸盐缓冲液冲洗3次，每次3～5 min。加入辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶的标志物，室温孵育10 min。磷酸盐缓冲液冲洗3次，每次3～5 min。滴加显色剂二氨基联苯胺（diaminobenzidine，DAB）（购自南京碧云天生物科技公司），复染，脱水，封片。

1.3 结果判断

MFN2蛋白阳性表现为细胞质出现棕黄色颗粒，Bmi-1蛋白阳性表现为细胞核出现棕黄色颗粒。染色强度：无着色为0分，浅黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。阳性细胞比例：﹤26%为1分，26%～50%为2分，﹥50%为3分。根据染色强度和阳性细胞比例之和判定，得分≥3分为阳性表达，﹤3分为阴性表达。

1.4 观察指标

比较膀胱癌组织和正常膀胱组织中MFN2、Bmi-1蛋白的表达情况，分析MFN2、Bmi-1蛋白表达与膀胱癌患者临床特征的关系，膀胱癌组织MFN2蛋白与Bmi-1蛋白表达的相关性。

1.5 统计学方法

采用SPSS 19.0统计软件分析数据。计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用t检验；计数资料以例数和率（%）表示，组间比较采用χ2检验；相关性分析采用Spearman秩相关性分析。P﹤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 膀胱癌组织与正常膀胱组织中MFN 2、Bmi- 1蛋白阳性表达率比较

膀胱癌组织中MFN2和Bmi-1蛋白的阳性表达率分别为52.50%（42/80）和61.25%（49/80），均高于正常膀胱组织的12.50%（10/80）和17.50%（14/80），差异均有统计学意义（χ2=29.174、32.073，P﹤0.05）。

2.2 不同临床特征的膀胱癌患者膀胱癌组织中MFN 2、Bmi- 1蛋白阳性表达率比较

TNM分期为Ⅰ～Ⅱ期的患者膀胱癌组织中MFN2蛋白的阳性表达率明显高于TNM分期为Ⅲ期的患者（χ2=15.402，P﹤0.01）；不同年龄、性别、肿瘤直径、分化程度、浸润深度、淋巴结转移情况的患者膀胱癌组织中MFN2蛋白的阳性表达率比较，差异均无统计学意义（P﹥0.05）。肿瘤直径﹥3 cm、TNM分期为Ⅲ期的患者膀胱癌组织中Bmi-1蛋白的阳性表达率均明显高于肿瘤直径≤3 cm、TNM分期为Ⅰ～Ⅱ期的患者（χ2=19.771、10.963，P﹤0.01）；不同年龄、性别、分化程度、浸润深度、淋巴结转移情况的患者膀胱癌组织中Bmi-1蛋白的阳性表达率比较，差异均无统计学意义（P﹥0.05）。（表1）

2.3 膀胱癌组织中MFN 2与Bmi- 1蛋白表达的相关性分析

表1 不同临床特征的膀胱癌患者膀胱癌组织中MFN 2、Bmi- 1蛋白阳性表达情况（ n=80）

经Spearman秩相关性分析，膀胱癌组织中MFN2蛋白表达与Bmi-1蛋白表达呈负相关（r=-0.602，P﹤0.01）。（表2）

3 讨论

膀胱上皮细胞恶性肿瘤的发生主要考虑与长期吸烟导致的上皮细胞恶性病变，或者家族性遗传易感基因的携带有关。膀胱癌的发生发展，能够导致患者高肿瘤临床负荷的出现，增加了患者近期病情进展的风险[6-7]。现阶段临床上缺乏对膀胱癌早期诊断的可靠的血清学肿瘤指标，而本研究对于相关患者体内MFN2、Bmi-1表达的分析研究，不仅能够揭示膀胱癌的发生发展机制，还能够为临床上膀胱癌血清学肿瘤指标的诊断提供参考。

表2 膀胱癌组织中MFN2与Bmi-1蛋白的表达情况（n=80）

MFN2不仅能够通过降低鸟苷三磷酸（guanosine triphosphate，GTP）酶的活性降低上皮肿瘤细胞对腺苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）能量利用的能力，抑制肿瘤细胞的增殖，还能够通过影响核基因转录上游的转录盒的开放阅读程度，降低转录激活程度，进而降低膀胱上皮细胞核基因异常突变和转录的风险。Bmi-1是多巯基相关蛋白，能够通过对肿瘤细胞表面配体蛋白末端结构的巯基化修饰作用，提高肿瘤干细胞持续性自我扩增的能力。Bmi-1的表达上调能够导致肿瘤细胞干性特征的显著增强，促进肿瘤细胞的复发和转移等病理过程。Bmi-1的表达上调能够影响端粒酶的活性及其结构的稳定性，导致肿瘤细胞增殖负性调控障碍。

本研究探讨了MFN2和Bmi-1在膀胱癌患者中的表达情况，发现在膀胱癌组织中MFN2和Bmi-1的阳性表达率均明显上调，提示MFN2和Bmi-1阳性表达均能够参与膀胱癌的病情进展过程。这主要与MFN2和Bmi-1的下列两个方面的作用机制有关：①MFN2表达上调，主要是由于肿瘤细胞异常增殖过程中线粒体融合程度增加，导致MFN2的反应性升高；②Bmi-1表达上调，主要是由于肿瘤细胞端粒酶活性改变，影响多巯基化修饰过程。白云等[8]也认为，在膀胱癌患者病灶组织中MFN2的表达水平明显升高，特别是在膀胱癌远期生存预后较差的患者中MFN2的表达水平可进一步的上升。免疫组化染色分析研究可见，MFN2和Bmi-1的表达主要定位于肿瘤细胞间质成分，推测MFN2和Bmi-1的表达能够影响肿瘤细胞间信号通路的传递或者肿瘤细胞膜内相关因子的激活，进而发挥其病理性作用。在探讨MFN2和Bmi-1的表达与膀胱癌患者临床特征的关系过程中，可以发现在临床分期较早的患者中，MFN2蛋白的阳性表达率较高，这主要是由于MFN2表达能够调控肿瘤细胞线粒体酶的稳定性，抑制因线粒体酶的过度激活导致的肿瘤细胞的浸润和转移。但本研究并未发现MFN2的表达与膀胱癌患者淋巴结转移或者分化程度的关系，提示MFN2的表达并不能影响肿瘤细胞的分化程度或者对淋巴结组织的黏附能力；在临床分期较晚或者肿瘤病灶直径较大的患者中，Bmi-1蛋白的阳性表达率较高，提示Bmi-1蛋白的表达与膀胱癌患者的临床特征有关，这主要是由于Bmi-1的表达能够提高肿瘤细胞的浸润程度，促进肿瘤细胞的转移，进而提高膀胱癌的临床分期。最后，本研究还发现，膀胱癌组织中MFN2、Bmi-1蛋白表达呈负相关，提示二者在促进膀胱癌病情进展的过程中可能发挥了一定的作用。

综上所述，膀胱癌患者的MFN2、Bmi-1蛋白的阳性表达率均明显升高，同时MFN2蛋白阳性表达情况与TNM分期有关，Bmi-1蛋白阳性表达情况与肿瘤直径、TNM分期有关。后续临床相关研究可以探讨MFN2、Bmi-1的表达与膀胱癌临床预后的关系。