转化生长因子β1/Smad信号通路与早发性卵巢功能不全相关性研究

赵锐 刘宴君 高步婵 许小翠

早发性卵巢功能不全是卵巢功能下降的进展后果，除了功能障碍更有器质性病变。严格来讲这种病理损害在现有医疗技术阶段，是不可逆的。对临床病例进行统计分析发现，由于现代社会对女性生存造成的压力等一系列原因，患有早发性卵巢功能不全的患者年龄阶段显著年轻化，严重影响女性生活质量的同时，还扩大了不孕症的患者群，正是这种不良影响引起了临床医生以及科研人员的警惕，使得加速早发性卵巢功能发病机制研究进展的需求提上日程。

一、早发性卵巢功能不全

1.早发性卵巢功能不全概念：早发性卵巢功能不全(primary ovarian insufficiency，POI),曾名卵巢早衰，定义为，年龄小于40岁女性的卵巢功能退化的临床综合征[1]。临床症状以过早的更年期表现常见，如：月经稀发，盗汗，心悸，情绪急躁，阴道干涩，性欲低下等。诊断标准为：(1)稀发月经或停经至少4个月。(2)检测时间间隔>4周,连续两次卵泡刺激素值FSH>25 U/L(对比参照IMS的诊断阈值FSH>40 U/L，ESHR的诊断标准更具有临床诊疗意义)[2]。早发性卵巢功能不足以低雌激素，高卵泡刺激素，以及高黄体生成素分泌为临床指标的特点。作为临床疑难症，早发性卵巢功能不全治愈率低，治疗效果差，危害女性健康，严重降低生活质量，其可能导致的不孕症对有生育需求的女性来说更是灾难性的打击。早在2008年据不完全数据统计显示，早发性卵巢功能不全在女性群体中的患病率为百分之一，且近年来患者年轻化显著，降低生活质量，严重危害女性健康。经临床实验观察总结，可以确定POI的发病与遗传因素[3]、免疫因素[4]、手术、化疗、放疗、酶缺陷、精神心理因素及吸烟[5]等密切相关。关于致病因素具体导致早发性卵巢功能不全发生的机制仍未有一个明确的说法，科研人员试图从信号通路的水平来进一步探究，TGFβ/Smad信号通路就是受关注较多的一个角度。

二、TGFβ/Smad信号通路

1.转化生长因子-β(TGF-β)：转化生长因子-β超家族是一类具有自分泌、旁分泌功能的细胞因子。目前研究发现其至少由35种细胞因子组成，包括五大亚型：转化生长因子-β亚型(TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3)、生长和分化因子(至少9个成员)、骨形态发生蛋白(20个成员)、激活素(含激活素A、激活素AB、激活素B)及抑制素(抑制素A、抑制素B)等[6]。TGF-β1是广受认可的多功能因子，参与胚胎发育，细胞的生长与分化，创伤修复，机体免疫，血管生成，肿瘤的形成以及炎症等各项进程[7]。转化生长因子-β亚型中TGF-β1、TGF-β2共同作用于TGFβ/Smad信号通路，并在信号传导中有着决定性的作用。

2.Smads蛋白家族：Smad蛋白是转化生长因子-β的直接作用底物，在哺乳动物中共发现8种蛋白，从结构和功能上主要可以分为3个亚族：5种配体蛋白(R-SMADs；Smad1/2/3/5/9)是TGF-β1的直接效应分子，1种通用型蛋白(Co-SMAD；Smad4)，是信号在通路中传导时，所有转化生长因子-β超家族的信号分子进入细胞核之前必需结合的蛋白,和2种抑制蛋白(I-SMADs：Smad6、Smad7)是TGFβ信号传导的抑制剂[8]。参与卵巢功能调控的smad蛋白是smad2、smad3、smad4、smad6、smad7。

3.TGF-β1/Smad的信号传导：TGFβ/Smad信号通路是近年来的明星通路，其在卵巢功能方面的作用得到广泛的认可，信号的传导是一个复杂的且受到多方干预的过程：首先，活化的超家族配体信号分子识别TGF-β2型受体并与之结合，TGF-β2自身磷酸化后以募集式与TGFβ1结合形成二聚体复合物而具有激酶活性。此时已经活化的TGFβ1将其底物smad2/3磷酸化，将信号传到磷酸化的受体，并与Smad4结合将TGFβ的信号由胞浆传递到胞核内，作用于特定的基因启动子，与许多辅助活化因子和辅助抑制因子协同作用调节靶基因的转录[9-10]。I-Smad则与R-smads竞争结合活化TGF-β1的机会，阻断信息的传导[11]。

图1 TGF-β1/Smad信号通路传导示意图

三、TGF-β1/Smad信号通路与早发性卵巢功能不全

TGF-β1/Smad信号通路在生命体中广泛的参于细胞的各项生命活动，参与介导组织与器官的正常生长和发育，在正常卵巢组织中有完整的TGF-β1/Smad信号通路，其中各个信号分子对颗粒细胞的分化与凋亡有着多层次的影响，并且干预卵泡的生长发育与排出，TGF-β1，smad2、smad3等的异常表达均会引起卵巢功能的异常。

1.TGF-β1异常表达对卵巢功能的影响：异常的TGF-β1表达导致卵泡发育障碍、无排卵。对雷公藤制备的大鼠模型进行镜下观察发现组织形态学的变化：卵泡膜细胞层增厚，而颗粒层数减少，排列致密、染色加深且间质增加；除此之外，更有闭锁卵泡数目增多，黄体数目减少，无优势卵泡等一系列卵巢功能下降的表现。对比空白组TGF-β1在卵巢颗粒细胞及间质细胞的表达，模型组的TGF-β1过表达明显。故路帅等认为，雷公藤导致卵泡发育障碍的机制与TGF-β1在颗粒细胞中的高表达有着因果关系，而其中机制与TGF-β1介导窦卵泡颗粒细胞的凋亡有着密切的相关性[12-13]。在刘慧萍的试验中，免疫性因素所致的卵巢早衰小鼠模型卵泡中颗粒细胞TGF-β1蛋白表达明显减弱，HE检测发现卵泡闭锁显著增加，再次提示TGF-β1的非正常表达对卵巢功能有负面影响[14]。胡兴文等人在对比TGF-β1在卵泡液和血清中TGF-β1的浓度时发现，前者明显低于后者，故推测TGF-β1没有卵巢源性，并产生了TGF-β1对卵母细胞的发育成熟有抑制作用的猜想[15]。对不孕症患者颗粒细胞进行离体培养发现，TGF-β1对颗粒细胞卵丘扩展相关基因PTX3、TNFAIP有促进作用，并呈浓度梯度正相关以及作用时间正相关[16]。

2.TGF-β1/Smad信号通路对卵巢功能的影响：TGF-β1在信号传导中通过对直接作用底物smad蛋白的影响参与调节雌激素的生成，对维持卵巢内环境稳态有着重要影响。早在2001年，吕时铭等[17]将人颗粒细胞离体培养，发现在无卵泡刺激素干预条件下TGF-β1可以使颗粒细胞分泌雌二醇，且适当浓度的TGF-β1可以增强fsh促进雌二醇分泌的效果。而卵泡刺激素FSH对Smad2/Smad3有激活作用，且依赖TGF-β2调节TGF-β1/Smad信号通路调控卵巢功能[18]。2008年Zheng等人的实验在验证了这一点的同时,还说明了TGF-β1通过抑制参与雄激素转化为E2的关键酶来抑制颗粒细胞中E2的合成[19]。除此之外，大量实验研究表明，TGF-β1/Smad信号通路同时介导颗粒细胞的凋亡以及卵泡的生发，而其具体作用分子是smads家族各成员蛋白。应用基因敲除技术，研究人员发现单独对雌性小鼠去除Smad3基因[20-21]将导致稳定动情周期的缺失，卵泡发育的紊乱，颗粒细胞凋亡的增加，进而导致卵泡闭锁的增加，对生育功能并无明显影响，然而在同时敲除Smad2与Smad3这一对基因时[22]，雌性大鼠则丧失生育功能。应用siRNA转染手段研究显示，Smad2和Smad3分别参与TGF-β1上调和PGE的生成，进而参与卵巢调控排卵的发生和发展[23]。Yu[24]等使用Cyp19-Cre小鼠，对其排卵前卵泡中的颗粒细胞特异性地清除Smad4，结果导致卵泡闭锁的增加，进一步分析发现，Smad4的缺失降低了Nppc和Npr2的表达，使其维持卵母细胞减数分裂阻滞的作用减弱，损害女性生育功能[25]。

三、总结

TGF-β1/Smad信号通路在卵巢的发生发育中有着非常重要的作用，任何一个信号分子对卵巢功能产生的影响都是复杂而多方的。TGF-β1通过对颗粒细胞的影响干预雌激素的生成，同时提高受体对fsh的敏感性，增强雌激素分泌效果，除此之外其在信号通路中通过对底物Smad蛋白影响对颗粒细胞的发育以及卵泡的发育排出都有着不同程度的影响。对于不同病因造成的早发性卵巢功能不全模型的观察提示我们TGF-β1的过高表达或者过低表达都会产生卵巢功能方面的障碍：尤为明显的化疗源性POI模型中卵巢组织的TGF-β1高表达以及免疫性因素导致的POI模型中TGF-β1低表达。我们可大体推测这种现象与TGF-β1对颗粒细胞的发生发育以及凋亡有联系，然而其中具体机理仍未有一个明确化的理论学说。信号在整条信号通路的传导受多个分子的调控和干预，而任何一个信号分子的上调或者下降导致的结果是多个作用叠加而导致的，我们应当从更加细致的角度来客观评价TGF-β1在整条信号通路中的影响，以诠释整条信号通路与疾病的相关性，例如基因角度。