儿童新诊断免疫性血小板减少症相关基因分析

马利敏，杨海平，杨学文，阮林海

免疫性血小板减少症(immune thrombocytopenia，ITP)是儿童最常见的出血性疾病，以皮肤黏膜出血和血小板计数减少为主要表现。儿童ITP是一种良性自限性疾病，绝大多数患儿病程小于3个月，预后良好，定义为新诊断ITP。但有20%～30%的患儿病程迁延反复，持续12个月以上，发展为慢性ITP[1]。科学研究表明，ITP是一种获得性自身免疫性疾病，免疫功能紊乱、遗传易感背景或继发因素引起血小板破坏增加和再生障碍在ITP的发病中起着关键作用，但具体机制尚未完全阐明[2, 3]。

基因芯片是一种高效的生物信息检测技术，能够检测样本中基因的表达水平，具有高通量、多参数、平行化等特点，在功能基因组学研究中发挥着重要作用。生物信息学运用信息科学的原理和技术分析基因组测序和其他高通量技术所产生的大规模分子数据集，使其更易解读，已成为生物医学研究领域所必需的工具[4]。本研究利用基因表达数据库(Gene Expression Omnibus，GEO)中儿童新诊断ITP相关基因芯片，对发病期和缓解期的基因表达谱进行比较，探索儿童新诊断ITP分子特征的变化，通过生物信息学分析描述ITP相关基因的功能分布情况以及明确其所参与的主要代谢途径和转导通路，为深入探索儿童ITP发生的分子机制和指导早期治疗提供基础。

1资料与方法

1.1资料来源 从在线GEO数据库中下载GSE56232基因芯片，该数据集包含了6例新诊断ITP患者发病期和缓解期的外周血T细胞表达谱[5]。试验共纳入6例新诊断ITP患儿，年龄0.7-13.8岁。分别收集6例患儿发病期(发病一周内且未接受任何治疗)和缓解期(至少12个月后且血小板计数持续> 150 × 109/l)的外周血，分离T细胞并提取总RNA，然后采用GPL570平台，即昂飞人类基因组U133 Plus 2.0基因芯片检测表达谱。

1.2差异基因筛选 把GSE56232数据集导入BRB-ArrayTools软件，进行芯片信号值的预处理、过滤和标准化。以缓解期为对照组，发病期为实验组，采用基因芯片显著性分析方法统计每个基因的显著水平P值和误判率Q值。本研究中差异表达基因(differentially expressed genes，DEGs)的筛选标准定义为：P<0.05，差异倍数≥2倍，同时计算基因间的Pearson相关系数，依照先基因、后样本的顺序对差异基因进行聚类分析。

1.3功能富集分析 基因本体(Gene Ontology，GO)是基因功能的标准化分类体系，包括生物过程、分子功能、细胞组分三种类型。本研究基于GO数据库，采用Fisher检验计算GO富集各条目的富集水平P值，同时用Benjamini-Hochberg法校正以控制错误发现率(false discovery rate，FDR)，显著富集GO条目的筛选标准定义为P<0.05，FDR<0.05。

1.4通路富集分析 通路富集分析是以KEGG数据库中的Pathway为基本单位，向背景基因组映射，通过统计检验从而明确差异基因所参与的主要代谢途径和细胞转导通路。本研究采用Fisher检验统计差异基因在Pathway中的富集水平，显著富集pathway的标准定义为P<0.05。

1.5互作网络分析 对于差异基因的表达谱数据，首先计算出各基因间的相关系数矩阵、各节点间的连接度和不相似度，再通过基因间的相互关系拟合基因的无标度网络关系，从而得到基因共表达网络[6]。根据图论原理，以Pathway为研究对象，将显著性富集的通路基于KEGG数据库中的相互作用关系构建通路互作网络[7]。

2结 果

2.1差异基因筛选 以新诊断ITP缓解期为对照组，发病期为实验组，从外周血T细胞表达谱中共鉴定出582个DGEs，包含45个上调基因，537个下调基因，其中细胞周期蛋白M2(cyclin M2，CNNM2)和前列腺素内过氧化物合酶2(prostaglandin-endoperoxide synthase 2，PTGS2)分别在上调和下调基因中差异变化最显著，部分差异基因列于表1。

表1 部分差异表达基因列表

2.2功能富集分析GO富集分析用来描述差异基因在功能分布上的情况。通过GO分类体系对差异基因注释后发现，显著富集的生物学过程共包括124个GO条目，主要包括DNA损伤与修复、转录调控、细胞周期、细胞因子、信号传导、血液凝固、蛋白修饰、细胞粘附与迁移等，富集水平最显著的前20个条目列于表2。另外，显著富集的分子功能共涉及38个GO条目，主要包括蛋白结合、白介素6受体结合、整合素结合、ATP结合、微管结合、DNA结合、蛋白激酶活性等。

2.3通路富集分析 通路富集分析发现儿童新诊断ITP相关基因主要富集于细胞周期、细胞骨架调节、转化生长因子β(transforminggrowthfactorβ，TGFβ)信号通路、白细胞迁移、丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activatedproteinkinase，MAPK)信号通路、细胞凋亡、Wnt通路等41个通路，富集水平最显著的前15条通路列于表3。

表2 差异表达基因GO富集分析

表3 差异表达基因通路富集分析

2.4互作网络分析 基于差异基因表达数据，通过基因间的相关系数拟合基因的无标度网络关系构建基因共表达网络，挖掘出的核心基因包括UBR3、ERBIN、KIF5B和SLK。基于KEGG数据库中信号通路的关系，以圆点表示通路，带箭头的实线表示通路的上下游关系，构建显著性通路之间的互作网络，挖掘出核心通路包括细胞凋亡、细胞周期和MAPK信号通路。见图1。

3讨 论

ITP的病因与发病机制目前尚不完全明确，随着研究的深入，儿童ITP被逐步认为是一种免疫失耐受疾病。一般认为ITP的发病是在遗传易感基因的基础上，在病毒感染或者接种疫苗等诱因下，机体免疫调节功能发生紊乱，导致免疫系统在处理外来抗原或血小板抗原时不能获得耐受。B细胞过度激活，产生抗血小板抗体而致敏血小板，单核巨噬细胞系统进而吞噬致敏的血小板，而T细胞及其亚群功能异常使B细胞异常活化产生血小板表面相关抗原抗体，加速了血小板破坏[3, 8, 9]。

图1通路相互作用网络分析

为了探索儿童新诊断ITP发病时基因表达水平的改变，本研究利用GEO数据库中相关基因芯片，对发病期和缓解期的表达谱进行比较分析，结果共鉴定出582个差异基因，包括45个上调表达基因和537个下调表达基因，其中CNNM2和PTGS2分别在上调和下调基因中变化最为显著。CNNM2主要参与镁离子转运和镁离子代谢平衡过程，其突变与肾性低镁血症相关[10]；PTGS也称为环氧酶(Cyclooxygenase，COX)，是合成各种前列腺素的关键酶。COX有两种同工酶，即组成型酶COX-1和诱导型酶COX-2。PTGS2基因编码诱导型酶COX-2，其表达受特异性刺激调节，如白细胞介素1(interleukin1，IL-1)、肿瘤坏死因子、表皮生长因子、雌二醇、药物等，参与炎症反应、有丝分裂、血管新生过程中前列腺素的合成，涉及NF-κB信号通路、血管内皮生长因子受体信号通路等。有研究发现PTGS2和前列腺素E合成酶共表达于成熟巨核细胞和血小板中，PTGS2基因缺失延迟骨髓巨核细胞生成，释放高反应性血小板，增加体内血栓形成能力，表明PTGS2表达有助于巨核细胞成熟和血小板形成[11,12]。聚类分析发现发病期和缓解期的表达谱在聚类树图中没有重叠，表明新诊断ITP发病期和缓解期的分子特征不同。

功能富集和通路富集分析结果表明儿童新诊断ITP相关基因主要参与转录调控、DNA损伤与修复、细胞周期、细胞因子、血液凝固、细胞粘附与迁移等生物学过程，涉及细胞周期、细胞骨架调节、TGFβ信号通路、MAPK信号通路、细胞凋亡、Wnt通路等信号通路。新诊断ITP患儿血清中TGF-β1水平显著高于正常对照组，患儿治疗前血清TGF-β1水平高于治疗后水平；且TGF-β1水平与ITP患儿血小板计数负相关，与骨髓内巨核细胞数正相关[13]。本研究发现TGF-β1在发病期表达水平升高，表明TGF-β1参与ITP的发病过程。造血系统中的TGF-β1是由巨核细胞和血小板生成，巨核细胞及血小板α颗粒是其最终存储点。TGF-β1通过与巨核细胞表面的受体结合，启动相应的信号途径发挥负性调节因子作用，使巨核细胞成熟障碍、血小板生成减少。ITP发病时，血小板寿命缩短和破坏增多使TGF-β1释放到血液中，引起TGF-β1水平明显增高，且TGF-β1与基质细胞中血小板生成素的增高水平正相关，从而导致巨核细胞成熟障碍[14]。新诊断ITP患儿Th17细胞比例增高，Treg细胞比例下降；ITP患儿血浆中γ干扰素水平较正常对照组明显升高，IL-4水平较正常对照组明显降低，表明Th17/Treg细胞亚群比例失调、γ干扰素表达上调、IL-4表达下降可能是ITP发生的重要因素[15]。γ干扰素、IL-10水平在ITP患儿血清中升高，激活细胞毒性T细胞、巨噬细胞、补体形成，进而吞噬破坏血小板。有研究报道新诊断ITP患儿血清中IL-16水平比持续性ITP和慢性ITP患儿高，持续性ITP患儿IL-16水平比慢性ITP患儿高，而且IL-16水平与血小板计数和网织血小板负相关，表明IL-16可用于预测儿童ITP的临床病程[16]。另外，本研究网络分析发现的核心基因包括UBR3、ERBIN、KIF5B和SLK，ERBIN参与NF-κB转录因子活性、肿瘤坏死因子、整合素信号通路、细胞粘附、表皮生长因子受体信号通路等，KIF5B涉及应激脱颗粒、基于微管的胞内运输、囊泡运输、蛋白定位、膜电位调节等，SLK主要参与细胞凋亡、细胞周期调控、应激激活蛋白激酶信号级联反应、蛋白磷酸化等，这些核心基因在儿童新诊断ITP发病期均表达下调，其作用机制有待进一步研究。

总之，通过对儿童新诊断ITP发病期和缓解期的芯片数据集进行比较和分析，新诊断ITP的发生涉及基因表达谱的改变。儿童新诊断ITP相关基因主要涉及细胞周期、细胞因子、细胞迁移、TGFβ信号通路、MAPK信号通路、细胞凋亡等生物过程与通路，为深入阐明儿童ITP发生的分子机制和指导治疗干预提供了基础。