调经助孕胶囊对促排卵周期小鼠子宫内膜αvβ3、MMP9及TIMP1表达的影响

王瑞霞，张晋峰，张淑芬

（山西省中医院，山西太原030012）

不孕不育症是影响育龄夫妇双方身心健康的世界性问题，据统计，我国约10%~15%育龄妇女患不孕症［1］，并有逐渐增加的趋势。生殖医学的迅速发展为广大患者带来曙光，通过调整促排卵方案等技术取卵率、成胚率均明显提高，但其种植率依然维持在30%~40%，严重影响了妊娠结局。因此，改善子宫内膜容受性，提高种植率已成为目前亟待解决的瓶颈问题。本研究观察调经助孕胶囊对促排卵小鼠整合素αvβ3、基质金属蛋白酶9（MMP9）及其抑制物 1（TIMP1）表达的影响，结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 动物与仪器 选择同一时期出生的健康清洁型昆明种小鼠，（8~9）w龄，雌性60只未交配过，雄性 30只证明有生育能力，体质量（30±5）g，14 h光照，10 h黑暗。实验室温度（26±2）℃，湿度（55±5）%，每笼5只，自由饮水，标准饲料喂养，环境安静。饲养1 w，待小鼠适应环境后用于实验。根据小鼠阴道涂片动情周期的表现，选择动情间期开始实验。高速低温离心机（Sorvall Products），PTC-150型PCR扩增仪（MJ Research）等。

1.1.2 药物与试剂 调经助孕胶囊（山西省中医药研究院制剂室生产），注射用尿促性腺激素，注射用绒毛膜促性腺激素（丽珠制药生产）。Trizol Reagent（INVITRIOGEN公司产品），逆转录聚合酶链（RT-PCR）反应试剂盒（TAKARA公司），PCR Marker（美国Fermentas公司产品），兔抗鼠整合素αvβ3多克隆抗体（武汉博士德生物工程有限公司），氯仿，异丙醇琼脂糖浆等。

1.2 方 法

1.2.1 造模与给药 将60只雌性小鼠按随机数字表法随机分为空白对照组（A组）、模型对照组（B组）、实验组（C组）各20只。以人的标准体重60 kg换算成35 g体质量小鼠的每日用药量，采用人与动物的体表面积计算法换算［2］。以许文生氏公式计算人的体表面积，再以Meeh-Rubner氏公式计算35 g小鼠体表面积，采用直接计算法获得小鼠的每日用药量，即雌性小鼠每日服用调经助孕胶囊0.1 g相当一般成人的每日服药量，连续每日定时灌胃给药10 d。实验组用调经助孕胶囊0.2 mL（采用水溶法制成溶液，含药物0.5 g/mL），模型对照组及空白对照组用等量生理盐水，第11天实验组与模型对照组同时腹腔注射HMG 12 IU，48 h后同时腹腔注射HCG 12 IU，空白对照组予0.1 mL生理盐水腹腔注射。注射HCG后各组按雌∶雄=2∶1比例分别合笼饲养，合笼当天做为妊娠第0天。于妊娠第5天脱颈处死所有小鼠，迅速剖腹，取出子宫，冲洗子宫后，于冰上刮取内膜，将一半内膜置于10%甲醛中，另一半内膜置于-80℃冰箱保存，待检。

1.2.2 检测方法 MMP9/TIMP1 mRNA检测参见试剂盒说明书。引物设计与合成：MMP-9引物序列参照文献说明［3］，TIMP-1引物的设计采用Oligo 6.0引物设计软件，根据GeneBank中TIMP-1的Cdna全长设计引物，β-Actin作为内参，均由武汉博士德生物工程公司合成。MMP-9：上游引物为5′-TTGAGTCCGGCAGACAATCC-3′，下游引物为 5′-CCTTATCCACGCGAATGACG-3，扩增片段为433 bp。TIMP-1：上游引物为 5′-CCAGAACCGCAGTGAAGAGT-3′，下游引物为 5′-ACGGCTCTGGTAGTCCTCAG-3′，扩增片段为 256bp。β-Actin：上游引物为 5′-ATGGGTCAGAAGGACTCCTATG-3′，下游引物为 5′-ATCTCCTGCTCGAAGTCTAGAG-3′，扩增片段为 542 bp。

整合素αvβ3检测。取出子宫内膜，剥离干净后放入4%多聚甲醛中固定，各级酒精脱水，石蜡包埋，切片，滴加αvβ3多克隆抗体一抗、二抗，封片，显色，镜检。

1.3 统计学方法

采用SPSS 13．0统计软件进行数据统计。计量资料用（x±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，等级资料采用秩和检验，P＜0.05认为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组小鼠着床期子宫内膜MMP9、TIMP1 mRNA表达

模型对照组小鼠着床期子宫内膜MMP9及TIMP1 mRNA表达低于空白对照组，差异具有统计学意义（P＜0.05），表明促排卵可导致小鼠着床期子宫内膜MMP9及TIMP1 mRNA表达下降。实验组小鼠着床期子宫内膜MMP9、TIMP1 mRNA表达及其比值均高于模型对照组，差异具有统计学意义（P＜0.05），提示补肾填精中药可增加促排卵周期小鼠着床期子宫内膜 MMP9、TIMP1 mRNA表达，调节MMP9/TIMP1平衡。结果见表1、图 1。

表1 三组小鼠子宫内膜MMP9、TIMP1 mRNA表达比较 （±s）

表1 三组小鼠子宫内膜MMP9、TIMP1 mRNA表达比较 （±s）

注：与空白对照组比较，1）P＜0.05；与模型对照组比较，1）P＜0.05

组别 n MMP9 TIMP1 MMP9/TIMP1空白对照组 20 0.93±0.06 0.80±0.05 1.05±0.04模型对照组 20 0.52±0.031） 0.62±0.041） 0.86±0.031）实验组 20 0.88±0.042） 0.75±0.052） 1.09±0.052）F值 9.536 7.015 6.594 P 值 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05

图1 小鼠子宫内膜MMP9、TIMP1 mRNA表达

2.2 各组小鼠着床期子宫内膜整合素αvβ3的表达

模型对照组小鼠着床期子宫内膜整合素αvβ3表达明显低于空白对照组，差异具有统计学意义（P＜0.05），表明促排卵可导致小鼠着床期子宫内膜整合素αvβ3表达下降。实验组小鼠着床期子宫内膜αvβ3表达明显高于模型对照组，差异具有统计学意义（P＜0.05），提示补肾填精中药可增加促排卵周期小鼠着床期子宫内膜整合素αvβ3的表达。结果见表 2、图2。

图2 小鼠子宫内膜整合素αvβ3表达

表2 三组小鼠子宫内膜整合素αvβ3表达比较

3 讨 论

3.1 子宫内膜容受性影响因素

研究表明整合素在子宫内膜种植窗口期的表达促成种植窗的开放，促进受精卵穿透蜕膜层和胎盘滋养层的形成［4］。其中整合素αvβ3 在子宫内膜上皮呈周期特征性表达，与内膜“着床窗”开放的时间相吻合，可作为子宫内膜容受性的分子标志［5］，决定胚胎侵入性。整合素 αvβ3 的表达已作为评价子宫内膜容受性的指标。

MMP-9抑制物TIMP-1在子宫内膜分泌期表达增加，尤其是在子宫内膜种植窗口期呈现强阳性表达，因此推测其与子宫内膜容受性有关［6］，认为MMP-9、TIMP-1的强阳性表达有助于加强蛋白水解酶活性，完成细胞外基化，促进子宫内膜的分化和蜕膜化，改善子宫内膜的容受性，为胚胎着床作准备。MMP-9在增殖早期的腺上皮几乎无表达，于增殖晚期及排卵后表达明显增强，在分泌早、中期也有较强表达，在月经第21、23天即围着床期表达达到高峰［7］。TIMP-1是MMP-9的天然特异抑制剂，特异性地抑制MMP-9的活性而参与ECM的调节，在正常种植期子宫内膜中，MMP-9/TIMP-1 的比值趋于 1［8］，两者处于一种势均力敌的制约状态，并且保持一种动态的平衡。Zhao YG 等［9］检测到 MMP-2、MMP-9 在大鼠孕第5、6天的着床点表达明显增高，MMP-9、TIMP-1于孕第6天着床部位的蜕膜带高度表达。MMP与其抑制物表达的平衡可能调控了胚胎的侵入及胚胎滋养细胞与母体血液循环的建立。

3.2 促排卵影响子宫内膜容受性

促排卵药物引起体内雌、孕激素水平异常升高，影响了着床期子宫内膜的形态和功能，从而降低了子宫内膜容受性［10］。绒毛膜促性腺激素（HCG）与黄体生成素（LH）的分子结构和生物学活性相似，可模拟内源性LH峰促进卵泡的最后成熟和诱发排卵，并有助于黄体发育。但HCG可引起月经黄体过早转变成妊娠黄体，分泌大量以孕酮为主的类固醇激素，使子宫内膜提前发育，与胚胎着床时间不一致，破坏了子宫内膜容受性［10］。克罗米芬是一线促排卵药，其排卵率高达50%～90%，而妊娠率仅11%～15%。分析其原因为克罗米芬的抗雌激素作用使宫颈黏液量少而黏稠，妨碍精子穿过；子宫内膜变薄，影响子宫内膜容受性，妨碍孕卵着床。

3.3 调经助孕胶囊改善促排卵周期子宫内膜容受性机理探讨

中医学认为肾藏精、主生殖，是“先天之本”，卵细胞乃精血所化，肾精、肾气与天癸是促使卵泡发育成熟的源泉，肾阳是卵泡排出的动力。卵细胞为肾精所化，得肾气、肝血以充养，赖肾气的调控激发和冲任调畅而生成、发育、排泄。若肾精亏虚，天癸分泌不足，冲任、胞宫、胞络失养，孕卵发育障碍，难与男精相合，则成不孕。促排卵药物要求短时间内卵泡急速发育，天癸大量分泌，耗损肾之阴阳，造成肾精愈加虚损，形成肾精亏虚之证。调经助孕胶囊是在《傅青主女科》养精种玉汤基础上加菟丝子、枸杞子、仙茅、仙灵脾、龟板、鹿角霜、丹参组成，全方以熟地、山萸肉补肾填精为君药，菟丝子、枸杞子补肾滋阴，仙茅、仙灵脾温肾助阳，共为臣药；佐以血肉有情之品龟板、鹿角霜调补肾阴肾阳，通补奇经之品以助孕。同时肾虚必血瘀，稍佐活血之当归、丹参、白芍等调经活血。全方共奏补肾填精、养血调经之功，是治疗肾精亏虚证不孕的有效方剂。

本研究表明：促排卵周期着床期小鼠子宫内膜MMP9及TIMP1 mRNA的表达水平均明显下降，MMP9/TIMP1比值下调；调经助孕胶囊可上调MMP9及TIMP1 mRNA的表达，调节MMP9/TIMP1平衡，改善子宫内膜容受性，利于胚胎植入。整合素αvβ3在实验组小鼠着床期子宫内膜中的表达明显高于模型对照组，差异具有统计学意义（P<0.05），表明促排卵可影响子宫内膜整合素αvβ3蛋白表达，可能是促排卵影响子宫内膜容受性的机制之一。