蛇床子素对佐剂性大鼠关节炎模型治疗作用研究

程永杰，张府君，吉海杰

（1.山西药科职业学院中药系，山西太原030031； 2.山西省中医院，山西太原030012）

类风湿性关节炎是一种以慢性侵蚀性关节炎为特征的自身免疫性疾病，临床上治疗的传统药物包括非甾体抗炎药、糖皮质激素和免疫抑制剂，这些药物的联合应用可缓解类风湿性关节炎病情，但长期服用这些药物具有副作用，例如非甾体抗炎药可引起胃肠道反应，免疫抑制剂可抑制机体免疫力，增加患者感染肺炎、肺结核的风险。因此，研究标本兼治、安全有效的天然药物有重要的意义。

弗氏完全佐剂诱导的大鼠关节炎与临床类风湿性关节炎的慢性系统性炎症具有很多相似性，因此通常被用做临床前研究模型［1］。其诱导的关节炎有两个阶段，急性局部炎症反应一般在3~4 d内出现，慢性系统性反应阶段一般出现在开始的2 w并持续数月［2］。弗氏完全佐剂诱导的关节炎可以很好地用于研究病理生理学以及炎症过程机制，同时可以用于评价药物的抗关节炎作用［3］。蛇床子素属香豆素类化合物，具有抗炎、抗凝血、抗心律失常以及抗过敏等药理作用［4-9］。本研究建立佐剂性关节炎大鼠模型，观察蛇床子素对大鼠关节肿胀以及炎症相关因子的影响，探讨蛇床子素对类风湿性关节炎的作用。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 药品与试剂 蛇床子素，购自成都龙泉高科天然药业公司，批号：484-12-8；完全弗氏佐剂，美国Chondrex公司；脱脂奶粉，德国欧蒙公司；大鼠TNF-α、IL-10 ELISA试剂盒，上海沪尚生物科技公司。二甲苯、乙醇、碳酸、伊红、中性树脂等化学试剂均购于国药集团化学试剂有限公司。

1.1.2 实验动物 健康清洁级Wistar大鼠50只，雌雄各半，体质量（150±10）g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号：syxk（京）2006-0024。将实验大鼠随机分笼，饲养于实训中心动物房，自由摄食和饮水，饮水瓶每日更换1次，垫料每2 d更换1次。

1.1.3 主要仪器 Sunrise酶标仪，瑞士Tecan公司；医用注射器，美国BD公司；电子天平秤（EL104型），上海越平科学仪器有限公司；-20℃冰箱，青岛海尔集团；数码照相机，日本尼康公司；病理切片机、自动脱水机、组织包埋机，德国Leica公司；倒置显微镜，日本Olympus公司；3K15型台式冷冻离心机，Sigma公司。

1.2 方 法

1.2.1 模型制备 将大鼠置于自制的固定盒子中，右后足跖皮内注射0.1 mL弗氏完全佐剂，诱导致炎，9 d后参照关节炎指数评分标准选取4分以上的大鼠用于后续实验。正常对照大鼠注射0.1 mL生理盐水。

1.2.2 动物分组与给药 造模10 d后选择造模成功大鼠随机分为蛇床子素低剂量组、高剂量组、模型组、阳性对照组，同时设正常组，每组10只。除模型组与空白对照组以自来水灌胃外，阳性对照组灌胃给予10 mg/kg的雷公藤多苷，蛇床子素低剂量组和高剂量组分别按照10 mg/kg和50 mg/kg灌胃给药，灌胃体积10 mL/kg，每日1次，连续2 w。

1.2.3 实验大鼠关节炎评分标准 根据表1标准进行评分。每只大鼠的评分包括大鼠所有病变关节评分的总和，最大分数为16分，评分越高，其症状越明显。

表1 大鼠关节炎评分标准

1.2.4 大鼠继发侧足体积测量 采用排水法分别于给药后第0、7和14天测量大鼠左后足体积，以最后1次左后足体积作为治疗效果评价指标。

1.2.5 T淋巴细胞亚群分析 末次给药后取外周血，EDTA抗凝；取2个试管，1个试管分别加入3种单抗（Mouse Anti-Rat CD3PE、Mouse Anti-Rat CD4FITC、Mouse Anti-Rat CD8PE-Cy7），1 个试管依次加入3种同型对照，充分混匀。然后，分别加入100 μL EDTA抗凝血，混匀，避光，室温孵育20 min；加入 500 μL 溶血素，混匀，避光，孵育 30 min；试管中加入3 mL PBS，混匀，1500 r/min离心5 min，上清液倒去，加入500 μL PBS，混匀；采用三色流式细胞检测技术分析，激发激光为488 nm，FSvSS设门，依次测定同型对照管和相应标本管。应用Navios Software分析得到各种T亚群数据和散点图，分析 CD3+、CD4+和 CD8+百分比，并计算 CD4+/CD8+。

1.2.6 继发侧后肢关节滑膜病理观察 继发侧膝关节正中纵行切开皮肤，分离肌肉，露出髌骨，继续向下分离纤维层，取出滑膜层组织，在10%福尔马林溶液中浸泡6 h，在4℃下于30%蔗糖溶液中过夜，用冷冻切片机切片，厚度为5 μm。冷冻切片置于溶液（无水乙醇和甲醛液各半）中固定30 s，自来水洗1~2 min。苏木素溶液染色1 min，自来水冲洗1~2 min。1%盐酸乙醇分化数秒后，自来水冲洗。1%氨水返蓝30 s后，流水冲洗。1%伊红染色 1 min，逐级乙醇（80%、95%、100%）脱水各5 min，二甲苯透明5 min，中性树胶封片。

1.2.7 血清细胞因子检测［10］取大鼠血清，用ELISA方法检测TNF-α和IL-10，做标准曲线，计算各细胞因子的相对浓度。

1.3 统计学方法

采用SPSS 16.0统计学软件进行结果处理，结果以均数±标准差（x±s）表示。统计分析采用OnewayANOVA或Mann-WhitneyU检验，以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠一般情况比较

实验期间，正常组大鼠饮水、进食、运动正常，体重稳定上升，皮毛整洁，精神状态良好；与正常组比较，模型组大鼠进食、饮水量下降，活动减少，皮毛光泽降低，且体重减轻，精神倦怠。各治疗组大鼠状态、活力、毛色等指标均优于模型组，体重均明显增加。结果见表2。

2.2 各组大鼠继发侧足肿胀度比较

与正常组比较，模型组大鼠继发侧足肿胀度随着时间延长逐渐加剧；与模型组比较，各治疗组均能降低足体积，并与剂量相关。结果见表3。

表2 各组大鼠体质量变化比较 （g，x±s）

表3 各组大鼠继发侧足肿胀变化比较 （mL，x±s）

2.3 各组大鼠关节炎评分比较

从造模第14天开始，模型组关节炎评分随着时间延长逐渐升高，与正常组比较显著提高。与模型组比较，蛇床子素各治疗组关节炎评分降低，并呈现与剂量相关趋势。结果见表4。

表4 各组大鼠关节炎评分比较 （分，x±s）

2.4 各组大鼠T淋巴细胞亚群分析

与正常组比较，模型组T细胞亚群中CD4+无明显变化，而CD3+和CD8+均显著增加，从而导致CD4+/CD8+降低。与模型组比较，蛇床子素各治疗组均不同程度降低CD3+和CD8+的比例，增加CD4+比例，从而提高CD4+/CD8+比值。结果见表5。

表5 各组大鼠T淋巴细胞亚群分析 （%，x±s）

2.5 各组大鼠继发侧关节滑膜病理观察［11］

正常组滑膜细胞结构清晰完整，排列整齐，无炎症细胞浸润，关节软骨光滑、完整；模型组关节滑膜增厚明显，滑膜内大量淋巴细胞浸润，成纤维细胞增生，关节软骨局部出现肿胀，脱落。与模型组比较，蛇床子素各治疗组滑膜表面光滑，有少量炎细胞，淋巴细胞浸润和胶原纤维增生改善明显，关节软骨光滑，其中以高剂量蛇床子素治疗组改善最为明显。结果见图1。

2.6 各组大鼠血清细胞因子TNF-α和IL-10含量比较

与正常组比较，模型组血清中TNF-α和IL-10含量显著升高；蛇床子素各治疗组与模型组比较，TNF-α和IL-10含量均有所降低，尤其是蛇床子素高剂量组最为明显。结果见表6。

表6 各组大鼠血清中TNF-α和IL-10含量比较 （ng/L，x±s）

3 讨 论

类风湿性关节炎在发达国家影响了人口的1%［12］，很多具有缓解类风湿性关节炎症状的药用植物具有与传统治疗药物类似的效果［13］。在人类关节炎以及佐剂诱导的大鼠关节炎模型中，常见四肢肿胀、炎症细胞增殖、关节滑膜增生、骨和软骨结构侵蚀等临床症状。由于病理特征类似，佐剂性关节炎大鼠模型被广泛用于类风湿性关节炎的研究，以评估抗炎药物的有效性［14］。

本研究结果表明，蛇床子素具有一定的类风湿性关节炎保护作用，能够显著改善弗氏完全佐剂引起的佐剂性关节炎大鼠的足肿胀程度以及炎症相

图1 各组大鼠滑膜组织HE染色

关因子的改变。但是，目前对其抗炎作用机制的研究还不甚清楚，有待于在今后的工作中进一步研究。