灵芝及其产品中麦角甾醇物质的测定方法

1. 湛江中医学校，广东 湛江 524094;2. 广东省微生物研究所，广东 广州 510070

灵芝为多孔菌科真菌赤芝GauodermaLucidum(Leyss. ex Fr.)Karst.或紫芝GauodermasinenseZhao Xu et Zhang的干燥子实体，具有补气安神、止咳平喘之功效[1]。灵芝是传统的名贵滋补中药，也是常见的保健食品，具有很高的经济价值。随着生活水平的提高，越来越多的消费者喜爱购买灵芝及其相关产品保健养生，尤其肿瘤病患者，更是乐于购买这些产品作辅助治疗。灵芝及其相关产品产量虽大但监管依据未健全，若没有有效的质量标准，灵芝及其加工品很难从外表判断其质的优劣，若不法商家以次充好，轻则给消费者造成经济损失，重则加重了原有的病情而危及人身安全，因此建立灵芝及其相关产品有效的质量控制方法是非常有必要的[2]。

目前行业内公认的传统功校验证指标尚显粗放，缺乏对灵芝及其相关产品的质量控制方法。因麦角甾醇类是菌类植物中特有成分，具有调节新陈代谢、调节激素水平、预防心血管疾病等功能，且在灵芝及其相关产品中含量较高，可作为评价灵芝及其相关产品质量的有力质量控制指标。故本研究建立了HPLC测定灵芝及其产品中麦角甾醇含量的方法，以期为灵芝及其产品的质量控制提供有效方法和检验依据[3-4]。

1 仪器与材料

1.1 仪器 安捷伦高效液相色谱；电子天平；水浴锅；旋转蒸发仪；循环水式真空泵；超声波清洗器。

1.2 材料 色谱纯甲醇；去离子纯净水；95%乙醇；分析纯石油醚。

麦角甾醇对照品购于中国药品生物制品检定所；灵芝及其相关产品均由广东粤微食用菌技术有限公司提供。

2 方法与结果

2.1 色谱条件[4-5]色谱柱：Agilent prep-C18 (250 mm×4.6 mm,5 μm )；流动相：98%纯甲醇；检测波长：282 nm；流速：1.0 mL/min；柱温：28 ℃；进样量：20 μL；外标法测定。

2.2 对照品溶液的制备 麦角甾醇标准工作液：精密称定麦角甾醇对照品10 mg，置50 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀超声，即得(每1 mL中含麦角甾醇0.2000 mg)。

2.3 供试品溶液的制备[6]灵芝提取物溶液：取本品1.0 g(n=3)，精密称定，置锥形瓶中，精密加入25 mL甲醇溶解，超声处理60 min，取出，放冷，用甲醇补足减失的质量，过滤，取滤液过0.45 μm微孔滤膜，置4 ℃冰箱保存。孢子油溶液：取灵芝袍子油0.5 g(n=3)，精密称定，置10 mL量瓶中，加无水乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀即得，过0.45 μm微孔滤膜，置4 ℃冰箱保存。

灵芝菌丝体/灵芝子实体/灵芝孢子粉/全灵芝孢子粉溶液：精密称取样品1.0 g(n=3)，加95%乙醇50 mL，恒温85 ℃水浴，回流1 h，过滤，于残渣中分别按上面方法提取3次，合并滤液，减压浓缩，用甲醇定容至10 mL，摇匀，0.45 μm滤膜过滤，置4 ℃冰箱保存。

2.4 供试品溶液制备方法的优选[7-8]

2.4.1 提取方法的选择 取干燥灵芝子实体1 g，用95%乙醇浸泡过夜，滤出上清液；残渣中加95%乙醇后超声30 min或85 ℃回流1 h，过滤合并滤液，浓缩，定容至10 mL，过0.45 μm滤膜，进样分析。实验结果表明，采用回流提取方法测得的麦角甾醇含量高于超声提取方法，故本实验采用回流提取。见表1。

表1 提取方法试验结果

2.4.2 提取溶剂的选择 取干燥灵芝子实体1 g，分别用甲醇、95%乙醇、石油醚等不同溶剂，以上述回流方式处理，结果表明采用甲醇为提取溶剂的麦角甾醇提取量最高，乙醇提取略次之，考虑到用乙醇的毒性及成本均低于甲醇，故选择乙醇为提取溶剂。见表2。

表2 不同溶剂回流提取试验结果

2.4.3 正交实验比较回流所用的料液比、提取次数及提取时间的组合选择 选取料液比、提取次数及提取时间作为考察因素，分别记为因素A、因素B和因素C，作三因素三水平正交试验。取干燥灵芝子实体1 g，用95%乙醇浸泡过夜，滤出上清液；残渣中加95%乙醇后按正交设计的方法在85 ℃进行回流，过滤合并滤液，浓缩，定容至10 mL，过0.45 μm滤膜，进样分析。见表3、表4和表5。

表3 L9正交实验因素与水平设计

表4 正交实验结果

表5 正交实验结果的方差分析表

讨论：使用软件“正交设计助手”对正交数据进行方差分析，结果表明各因素对综合评分的影响都无显著性意义。极差分析表明，因素A(料液比)为主要影响因素，其次是提取次数因素，各因素作用主次顺序为A>B>C，通过综合考虑确定，最佳方法为A3B3C1，即料液比为1∶50，提取3次，每次回流1 h。

2.5 标准曲线与线性范围[9-10]分别精密吸取对照品贮备液溶液10, 8, 4, 2,1 mL置于10 mL容量瓶中。加甲醇稀释至刻度，摇匀，制得不同浓度对照品溶液。过0.45 μm微孔滤膜后分别吸取20 μL标品溶液注入液相色谱仪。以峰面积(x)为横坐标，对照品麦角甾醇的进样量(y)为纵坐标，得线性回归方程。线性回归方程为：y=13.32x-24.32 ，r=0.9997，结果表明麦角甾醇在20-200 μg/mL呈良好的线性关系。定量限设定为20 g/mL，最低检出限视所用仪器信噪比而定，一般为信噪比的2～10倍，本标准检测限位0.2 g/mL，与目前国内文献检测限相比，具有一定优势。色谱图如图1所示。

2.6 样品含量测定 按2. 3项下方法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件进行含量测定，根据样品测定的色谱峰面积，以外标法计算样品中麦角甾醇的含量，计算公式:X= C×V/(M×1 000)，式中: X为试样中游离麦角甾醇的含量(mg/g);C为游离麦角甾醇的质量浓度(g/ mL); V为试样定容体积(mL); M为试样的质量(g)。测定结果见表6。

表6 试样测试结果

2.7 方法性能指标考察[11]

2.7.1 精密度试验 精密吸取麦角甾醇对照品浴液(0.2 000 mg/mL) 20 μL，连续进样6次，分别测定其峰面积值，计算峰面积积分值RSD为0.5%, 表明该仪器精密度良好。

2.7.2 重复性试验 精密称量样品6份，按1.3项方法制备，进样20 μL，测定其峰面积值，计算峰面积积分值的RSD为1.2%，表明该方法重复性良好。

2.7.3 稳定性试验 将样品溶液在室温下贮存,每间隔0、2、4、8、12、24 h各进样20 μL，测定其峰面积，RSD为1.08%，说明样品溶液在24 h内稳定。

2.7.4 加样回收率试验 精密称取己知含量的供试品，分别加入麦角甾醇标准品1.90 mg、2.40 mg、2.80 mg，按照上述样品的制备和分析步骤测定其峰面积值，计算回收率。见表7。

由表7可知，麦角固醇的回收率在98.50%～99.93%之间，表明回收良好，此方法稳定可靠，适宜于灵芝及其相关产品中麦角固醇含量的测定。

表7 加样回收率试验结果

3 结论

本研究建立的HPLC 测定麦角甾醇含量的方法，能准确地测定灵芝及其相关产品中该成分的含量。经过精密度实验、重复性实验、稳定性实验、回收率实验验证，该方法均符合测定要求。该方法操作简便，稳定性好，重现性高，特异性强，可作为灵芝及其产品中麦角甾醇的有效测定方法和质量控制标准，对于其他真菌的麦角甾醇含量测定与质量评价方法的建立也有参考价值和依据。