食管癌甲基化驱动基因的筛选、功能及调控通路分析

谢俞宁，仵红娇，杨振邦，高慧，侯俊志，张雪梅

(华北理工大学，河北唐山063210)

在全球范围内，食管癌的新发病例每年约48万例，其癌症致死率排第6位[1]。随着生命科学技术的发展，特别是二代测序技术的推广，加深了我们对食管癌基因组特点的理解。研究[2]发现，继基因突变和拷贝数变异之后，DNA甲基化是又一通过改变机体稳态继而影响肿瘤发生发展的重要机制之一。目前，高通量甲基化数据已经被广泛深入研究，然而直接识别甲基化驱动基因的方法依旧十分缺乏。R语言中的MethylMix包基于β混合模型鉴定甲基化状态，并与正常DNA甲基化状态相比，使用差异甲基化值(DM值)来定义疾病DNA甲基化状态与正常DNA甲基化状态的差异，可将基因表达数据和甲基化数据联合分析，从而达到筛选甲基化驱动基因的目的[3]。本研究应用生物信息学方法筛选食管癌甲基化驱动基因，并进行功能及调控通路分析，为寻找食管癌潜在标志物提供依据。

1 资料与方法

1.1 数据获取和预处理 搜集TCGA数据库中基因表达数据、DNA甲基化数据、临床信息完整的食管癌患者资料162例，记为肿瘤组；其中16例食管癌患者还有癌旁对照资料，记为对照组。基因表达数据为TCGA RNA-Seq Level 3数据，使用R语言edgR包对基因表达数据进行标准化处理；DNA甲基化数据由Illumina HumanMethylation 450 BeadChip测得，使用R语言Limma包对DNA甲基化数据进行芯片归一化处理。162例食管癌患者中，白种人99例(占61.1%)，黄种人40例(占24.7%)，黑种人3例(占1.9%)，种族情况未知20例(占12.3%)。

1.2 食管癌甲基化驱动基因的筛选 使用R语言MethylMix包综合分析两组患者的基因表达数据和DNA甲基化数据。R语言MethylMix包定义肿瘤组和对照组甲基化平均值的差值倍数为DM值，Spearman相关分析法分析基因表达与甲基化相关性(P<0.05为差异有统计学意义)，以|DM值|>0、|相关系数(Cor)|>0.3为截断值筛选甲基化驱动基因[4]。

1.3 食管癌甲基化驱动基因功能及调控通路分析 使用在线分析软件DAVID 6.8(https://david.ncifcrf.gov/)对食管癌甲基化驱动基因进行基因本体(GO)功能富集分析。使用在线数据库KOBAS 3.0(http://kobas.cbi.pku.edu.cn/)对食管癌甲基化驱动基因进行京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路分析[5]。

2 结果

2.1 食管癌甲基化驱动基因筛选结果 筛选得到88个食管癌甲基化驱动基因，由DM值可见，其中74(84.1%)个为高甲基化驱动基因(DM值>0,Cor<0,P<0.05)，14个为低甲基化驱动基因(DM值<0,Cor<0,P<0.05)。74个高甲基化驱动基因分别为FERMT3、VSIG2、AC005498.3、HOXA13、ERN2、ECHDC3、ZNF568、USP44、ZKSCAN7、ZNF790、NME5、ZNF85、TMEM220、HOTTIP、SYCP2、NKAPL、ZNF69、HOXB-AS3、HOXB6、SERP2、ZNF880、ZNF583、ZNF582、PHYHD1、ZNF677、ZNF454、CCDC8、GDF6、ZNF300P1、CKMT2、LINC01354、SLC39A7、GALNT3、AMT、SOST、REC8、IGFBP2、TMEM129、HTR1B、ZNF738、IDH2、GSTM2、TSPY26P、BSG、MFAP4、ZNF334、DLX6、TRIM8、GPBAR1、EN1、CCDC181、RGS22、AF186192.1、HOXA7、LEAP2、PDPN、AC011239.2、MPC2、KLHDC7B、C19orf67、RNF5、HOXA-AS3、GPR25、GLDC、CEBPA-AS1、ABCC9、BCL6B、NKX6-1、EPHX3、GPR150、SOX1、FUT9、UQCRFS1、SLC10A4，14个低甲基化驱动基因分别为MKRN3、KRT5、CSAG1、MIR205HG、AIM2、LINC00898、TM4SF19、SOWAHC、VCX3A、AC016735.2、TTC30A、OLFM4、LRRIQ4、DAPP1。按照|cor|值由大到小进行排序，可见最可能(|cor|最大)出现甲基化的食管癌甲基化驱动基因有Makorin环指蛋白3(MKRN3)基因、人Fermitin家族同系物3(FERMT3)基因、含V-Set免疫球蛋白域蛋白2(VSIG2)基因等。

2.2 食管癌甲基化驱动基因的GO功能 在分子功能层面，食管癌甲基化驱动基因主要影响了金属离子结合、DNA结合、转录因子活性、序列特异性、核酸结合；在生物学过程层面，食管癌甲基化驱动基因影响了转录调控、DNA模板化；在细胞成分层面，食管癌甲基化驱动基因影响了核组分、胞内组分。同时，我们发现锌指蛋白家族如ZNF582、ZNF69、ZKSCAN7、ZNF583、ZNF568、ZNF454、ZNF790、ZNF880等和SOX1基因被富集在了多个GO中。在分子功能、生物学过程、细胞成分层面发挥不同功能的基因见表1。

表1 在分子功能、生物学过程、细胞成分层面发挥不同功能的基因

2.3 食管癌甲基化驱动基因的调控通路 KEGG通路分析发现，食管癌甲基化驱动基因主要参与了乙醛酸和二羧酸代谢通路(通路编号hsa00630)，甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢通路(通路编号hsa00260)，碳代谢通路(通路编号hsa01200)及谷胱甘肽代谢通路(通路编号hsa00480)的调控。

3 讨论

我国是食管癌高发国家，每年新发病例数超过22万例，90%的患者确诊时已至中晚期，预后较差，食管癌负担水平约为世界平均水平的2倍。DNA甲基化芯片具有高通量、高敏感性的优势，在疾病诊断学、组织学等多个领域中有着极为广泛的应用[6]。本研究使用的Illumina HumanMethylation 450 BeadChip可以测到超过450 000个位点的DNA甲基化信息，覆盖了多数CpG岛和启动子区。目前对DNA甲基化修饰的的挖掘方法主要是分别筛选差异表达基因和差异甲基化基因，对两者取交集，寻找低甲基化高表达基因和高甲基化低表达基因作为可能受到甲基化修饰调节的基因，然后进行GO功能富集和KEGG通路分析，这种方法一定程度上忽略了基因表达与甲基化的相关关系。R语言MethylMix包首先考虑甲基化水平与基因表达的相关性，使用DM值来定义DNA的甲基化水平，构建混合模型识别甲基化驱动基因，相比传统方法具有优越性。

本研究共筛选出88个食管癌甲基化驱动基因，最可能受甲基化调控的基因有MKRN3基因、FERMT3基因、VSIG2基因等。MKRN3基因与Prader-Willi综合征有关，于2013年首次在5个有中枢性性早熟患者的家族研究[7]中发现。最近一些研究[8]表明，中枢性性早熟患者中，MKRN3、KISS1、KISS1R和DLK1等基因均发生了不同程度的突变，且中枢性性早熟与乳腺癌的发生发展密切相关。但是在食管癌患者中，对MKRN3基因的作用依然知之甚少。在本研究中，我们发现MKRN3除通过基因突变影响其自身功能外，DNA甲基化修饰也可能发挥了重要作用。研究[9]结果显示，FERMT3在神经胶质瘤中通过整合素介导的Wnt/β-连环蛋白信号传导调节神经胶质瘤细胞活性，增强胶质瘤细胞的存活和化疗耐药性。在一项有关结肠癌患者的研究[10]中，FERMT3的过表达可导致食管癌细胞系增殖和侵袭能力增强。VSIG2基因目前仅在系统性红斑狼疮全基因组关联研究[11]中有过报道，认为VSIG2单核苷酸多态性与系统性红斑狼疮的血清学特征有关，但其同家族基因VSIG4在肺癌、神经胶质瘤、卵巢癌的发生发展中起重要作用，本研究中筛选其为甲基化驱动基因，或为VSIG2基因在食管癌中的研究提供新的思路。

通过GO功能富集分析，我们发现锌指蛋白家族中的食管癌甲基化驱动基因富集在了多个GO中。锌指蛋白家族是人类基因组中最大的转录因子家族，锌指结构基序的多样化组合和功能使锌指蛋白在生物过程中有多种用途，包括发育、分化、代谢和自噬。然而，锌指蛋白家族在癌症进展中的潜在机制在不同的癌症类型中有所不同，甚至在相同的癌症类型中也不一样[12]。本研究提示，锌指蛋白家族的甲基化修饰可能对食管癌的发生发展中起到了重要作用。同样，被富集在多个GO中的SOX1基因被认为是肿瘤抑制基因，其启动子区域的高度甲基化被认为是其在鼻咽癌中低表达的原因。Lin等[13]通过体内和体外实验发现，SOX1基因的过表达可抑制宫颈癌细胞增殖和侵袭，起肿瘤抑制剂的作用。同时，SOX1基因在卵巢癌中也发现了类似作用。通过检索发现，SOX1在食管癌中的研究尚不充分，值得进行进一步的探究。

通过KEGG通路分析，我们发现食管癌甲基化驱动基因主要影响了代谢相关的多个通路。丝氨酸可以通过甲基转移酶SHMT1(细胞质内)和SHMT2(线粒体内)转化为甘氨酸，最近的研究发现癌细胞需要SHMT(特别是SHMT2)以获得最佳增殖和致瘤性，这表明丝氨酸代谢在癌症发生发展中的重要性。碳代谢通路在癌症的发生发展过程中意义重大。研究[14]谷胱甘肽(GSH)对细胞周期的调控至关重要，在肝癌细胞和转移性黑色素瘤细胞中，癌细胞的增殖和转移活性与谷胱甘肽表达呈现直接相关性。在肿瘤发生发展过程中伴随着代谢途径的再编程，KEGG通路分析结果提示，肿瘤代谢再编程可能受到了甲基化修饰的调控。

综上所述，食管癌甲基化驱动基因有88个，以高甲基化驱动基因为主；最可能发生甲基化调控的食管癌甲基化驱动基因有MKRN3基因、FERMT3基因、VSIG2基因等；食管癌甲基化驱动基因主要影响了金属离子结合、DNA结合等分子功能，转录调控、DNA模板化等生物学过程，核组分、胞内组分等细胞成分；食管癌甲基化驱动基因主要影响了代谢相关的多个通路。本研究通过生物信息学方法，初步分析了食管癌甲基化驱动基因可能参与食管癌调控的基因和信号通路，为寻找食管癌潜在标志物提供依据。另外，本研究纳入人群以白种人为主，可能无法很好的代表黄种人的实际基因表达水平和甲基化水平，后续仍需要在黄种人中进行验证。