水飞蓟素灌胃对糖尿病肾病大鼠肾损伤的改善作用及其机制

翁雅琴，张红，徐文东，石敏，张日东，李伟

(1徐州医科大学，江苏徐州221000；2南京医科大学附属淮安第一医院；3 徐州医科大学附属医院)

糖尿病肾病(DN)是糖尿病患者的微血管并发症，是发达国家终末期肾病(ESRD)的最常见原因，在发展中国家的患病率和死亡率也在急剧上升[1，2]。DN病理改变包括肾小球和肾小管肥大、基底膜增厚和系膜增生，最终进展为肾小球硬化和肾小管间质纤维化[3]。尽管目前对DN的治疗取得了一定效果，例如严格血糖、血压控制以及肾素-血管紧张素系统阻断剂的使用，但这些方法依旧无法阻止DN的进展。越来越多的研究[4]表明，慢性低水平炎症及纤维化在DN发生发展中起关键作用，并且是DN进展为ESRD的常见途径。研究[5，6]显示，在DN患者肾脏中存在显著的巨噬细胞浸润、黏附分子及炎症细胞因子活化增加。因此，对抗炎机制的研究为DN提供了新的治疗策略。天然黄酮木脂素类化合物水飞蓟素(Silymari，Sly)是从菊科药用植物中水飞蓟提取出来的一种生物活性物质[7]。研究[8～10]表明，Sly具有抗炎、抗氧化、抗纤维化、抗病毒和抗肿瘤等作用，已被应用于肝病的治疗。目前，国内外对于药用植物对肾脏的保护作用给予了更多关注。研究[11，12]发现，Sly可以有效减少2型糖尿病肾病患者的蛋白尿水平，但具体机制并不明确。2017年4月～2017年7月，本研究通过链脲佐菌素(STZ)诱导制备DN大鼠模型，在此基础上给予Sly灌胃治疗，并观察大鼠肾组织病理形态变化和血清炎症细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6及肾小管CD14表达变化，判断Sly对DN大鼠肾损伤的改善作用，并探讨其作用机制。

1 材料与方法

1.1 大鼠、试剂及仪器 SPF级8周龄健康雄性SD大鼠40只，体质量180～200 g，均购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司，动物许可证号：SCXK(沪)2013-0016。Sly、STZ购自美国Sigma公司。大鼠血清肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)和白细胞介素-6(IL-6)ELISA试剂盒购自奥地利Bender MedSystems GmbH公司。CD14一抗购自美国CST公司；山羊抗兔二抗购自南京优宁维公司。欧姆龙血糖仪HEA-230、欧姆龙血糖试纸HEA-STP30购自欧姆龙健康医疗(中国)有限公司。FA2004电子天平购自上海上平仪器有限公司。奥林帕斯DX45显微镜、DP72相机购自美国热电MK3酶标仪。

1.2 大鼠分组、DN模型制备、Sly灌胃方法及标本留取 大鼠在室温21～27 ℃、湿度40%～70%环境下，饲养在12 h自然光照交替的屏障系统内，进食、饮水随意并保持垫料干燥。大鼠经适应性饲养1周后, 将40只SD大鼠随机分为4组(每组10只)：糖尿病肾病组(DN组)、水飞蓟素低剂量治疗组(Sly-L组)、水飞蓟素高剂量治疗组(Sly-H组)、对照组。制备模型前，大鼠予以禁食12 h，测空腹血糖(FPG)，选取FPG<8.9 mmol/L的大鼠制备模型。DN组、Sly-L组、Sly-H组均采用STZ诱导制备DN大鼠模型：腹腔一次性注射STZ溶液，注射体积1 mL/100g，注射剂量60 mg/kg。模型制备72 h后测FPG，FPG≥16.65 mmol/L表示模型制备成功。经检测，DN组、Sly-L组、Sly-H组大鼠均符合要求。对照组大鼠腹腔一次性注射等体积0.1 mol/L枸橼酸缓冲溶液(pH 4.5)。模型制备成功后，Sly-L组大鼠每24 h给予低剂量Sly(60 mg/kg)灌胃1次，Sly-H组大鼠每24 h给予高剂量Sly(120 mg/kg)灌胃1次，DN组、对照组给予等量生理盐水灌胃。各组大鼠灌胃8周后，采用代谢笼收集24 h尿液，取空腹鼠尾静脉血及眼眶血，然后处死大鼠，处死大鼠后迅速切取两侧肾脏，使用预冷生理盐水灌洗去除残留血液，滤纸吸干后备检。

1.3 各组大鼠FPG、尿白蛋白/肌酐比值(UACR)、体质量、肾脏指数(KI)测算 ①取鼠尾静脉血检测FPG。②取代谢笼收集的大鼠24 h尿液，采用双缩脲比色法测定24 h尿白蛋白和肌酐，计算UACR。③称取处死后大鼠体质量。④取切除的大鼠双肾称重，计算KI。KI=大鼠肾脏重量/大鼠体质量。

1.4 各组大鼠血清炎症细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6检测 采用ELISA法。取大鼠眼眶血，分离血清，3 000 rpm离心5 min，取上清，采用ELISA试剂盒检测，实验过程中严格按试剂盒说明书操作。利用酶标仪在450 nm波长处检测各组吸光度值，得出标准曲线，计算各组大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6浓度。

1.5 各组大鼠肾组织病理形态学检查 采用HE染色。取右肾组织用10%甲醛固定，梯度乙醇脱水，石蜡包埋，制备4～5 μm厚连续切片，HE染色后，光学显微镜下观察。

1.6 各组大鼠肾小管CD14检测 采用免疫组织化学法。取各组右肾组织石蜡切片，常规二甲苯脱蜡，梯度乙醇浸泡 5 min，双蒸水冲洗5 min除去乙醇，抗原修复，去离子水孵育10 min，BSA封闭15 min，与兔抗CD14一抗一起4 ℃孵育过夜，37 ℃复温1 h，用相对应的二抗室温孵育15 min。应用新鲜配置的DAB显色，并在 200倍显微镜下随机选取肾脏皮质区10个视野，采用Image pro plus 6.0图像分析系统观察，检测肾小管CD14阳性细胞(肾细胞胞质中CD14呈棕黄色为阳性)的累积光密度(IOD)值，以IOD值表示CD14的相对表达量。

2 结果

2.1 各组大鼠FPG、UACR、体质量、KI比较 如表1所示，与对照组相比，DN组、Sly-L组及Sly-H组大鼠FPG、UACR、KI水平显著升高(P均<0.01)，体质量显著降低(P均<0.01)。与DN组相比，Sly-L组、Sly-H组大鼠FPG、UACR、KI水平均显著降低(P均<0.05)。

表1 各组大鼠FPG、UACR、体质量、KI比较

注：与对照组相比，*P<0.01；与DN组相比，#P<0.05。

2.2 各组大鼠肾组织病理形态学变化 对照组肾小球以及肾小管形态结构正常，肾小球体积及细胞数目无明显改变，毛细血管腔及球囊腔可见，肾小球系膜基质完整，基底膜未见增厚，肾小管上皮细胞无明显变性、坏死，管腔内无管型；DN组肾小球体积增大，部分肾小管管腔轻度或中度扩大，肾小管上皮细胞空泡样变性，可见炎性细胞浸润；与DN组相比，Sly-L组及Sly-H组肾小管和肾小球病理损伤减轻,见图1。

2.3 各组大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6及肾小管CD14比较 与对照组相比，DN组、Sly-L组血清TNF-α、IL-1β、IL-6及肾小管CD14均显著升高(P均<0.05)，Sly-H组血清IL-6水平显著升高(P<0.05)。与DN组相比，Sly-L组、Sly-H组血清TNF-α、IL-1β、IL-6及肾小管CD14均显著降低(P均<0.05)。与Sly-L组相比，Sly-H组血清TNF-α、IL-1β、IL-6及肾小管CD14均显著降低(P均<0.05)。见表 2。

表2 各组大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6及肾小管CD14比较

注：与对照组相比，*P<0.05；与DN 组相比，#P<0.05；与Sly-L组相比，☆P<0.05。

3 讨论

Sly是从菊科药用植物水飞蓟种子的种皮中提取出来的一种黄酮木脂素类化合物，因其具有抗炎、抗氧化及促进细胞再生的作用，被广泛应用于临床肝病的治疗[7]。最近的研究[13]表明，Sly还具有防治糖尿病、抗肾小管间质纤维化等作用。目前，用于治疗糖尿病及其并发症的传统药物均可引起严重的不良反应，因此，探索新的治疗干预措施十分必要。近几十年来，天然化合物Sly在DN中的作用受到国内外越来越多的关注，但Sly的具体作用机制并不十分清楚。Sheela等[14]应用STZ和烟酰胺诱导制备DN大鼠模型，接受Sly治疗组大鼠血糖、糖化血红蛋白、尿白蛋白水平均显著降低，组织病理学评估显示病理损伤减少。本研究中，DN组大鼠FPG、UACR、KI水平显著升高，体质量明显减轻，经过Sly治疗后，FPG、UACR、KI水平显著显著降低，但体质量较DN组无明显改变。此外，肾组织病理形态学检查发现DN组大鼠肾小球体积增大，上皮细胞排列紊乱，肾小管呈空泡样变性，并可见炎性细胞浸润，而Sly-L组、Sly-H组大鼠肾组织病理改变较DN组明显好转。上述结果提示，Sly对DN大鼠肾组织损伤具有一定改善作用。

DN发生机制主要包括肾小球高滤过引起的肾小球囊内压升高、炎症、氧化应激、晚期糖基化终末产物(AGEs)的堆积、多元醇和蛋白激酶C(PKC)途径的活化、转化生长因子-β(TGF-β)的过度表达[3]。DN发病机制复杂，到目前为止尚未完全阐明。最近研究[15]表明，慢性低水平的炎症在DN发生发展中起关键作用。在调节DN炎症反应的炎症细胞中，巨噬细胞发挥着重要作用。临床及动物研究[16]显示，肾组织巨噬细胞异常浸润、募集与活化能够导致肾脏免疫炎性损伤，肾组织巨噬细胞浸润程度与肾脏病理学损害、蛋白尿水平、肾小球硬化、肾脏纤维化密切相关。DN高糖状态下，AGEs异常蓄积，导致肾脏固有细胞或巨噬细胞活化，活化的巨噬细胞能够释放大量促纤维化因子及促炎症因子加重肾损害。CD14属于细胞表面糖蛋白家族成员，是革兰阴性细菌细胞壁成分脂多糖(LPS)的受体，主要表达在单核-巨噬细胞表面。研究[17]显示，CD14可通过脂多糖结合蛋白(LBS)与LPS特异性结合，并通过Toll样受体4以及MD2蛋白向下游传递活化信号，启动单核-巨噬细胞系统，并释放多种趋化因子及炎症细胞因子，如TNF-α、IL-6、IL-1、转化生长因子、基质金属蛋白酶、转化生长因子-β(TGF-β)、血小板衍化生长因子(PDGF)等，进一步激活NF-κB，进而通过一系列途径促进DN的发生发展。研究[18]表明，Sly能够通过抗炎作用发挥肾保护作用，但具体机制并不十分清楚。炎症细胞因子如TNF-α、1L-6、1L-1β在DN发病机制中起重要作用[19]。高血糖可直接刺激肾小球系膜细胞增生，刺激炎症因子分泌，导致肾脏损伤；另外可通过激活单核-巨噬细胞等，刺激炎症细胞因子如 TNF-α、1L-6、1L-1β释放增加，反过来刺激巨噬细胞产生及肾脏固有细胞炎症损伤，刺激趋化因子、黏附分子、致纤维化因子TGF-β等表达增加，激活NF-κB核转移，正反馈促进炎症相关因子的表达，导致炎症反应扩大[20]。这些炎症细胞因子激活促使肾小球系膜细胞分泌增多，导致系膜外基质(ECM)大量堆积，最终导致肾脏纤维化。Fallahzadeh等[21]研究发现Sly可以减少DN患者尿白蛋白排泄，并能够减少TNF-α和丙二醛等炎症细胞因子的表达，显示出Sly具有一定的肾脏保护作用，且可能与抑制炎症反应及NF-κB有关。本研究结果显示，DN组大鼠血清炎症细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6水平和肾小管CD14表达水平显著升高，而在Sly治疗后，大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6和肾小管CD14CD14表达显著降低，且Sly-H组下降更明显，提示Sly可能通过减少巨噬细胞浸润从而抑制炎症反应发挥保护DN的作用，并可能存在一定剂量依赖性。

综上所述，Sly可改善DN大鼠肾损伤，降低DN大鼠血清炎症细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6的水平并抑制肾小管CD14的表达可能是其作用机制。Sly在DN治疗中具有较好的应用前景，但仍有待进一步深入研究。