2016—2017年山东省济南市犬布鲁氏菌病血清流行病学调查

黄迪海 ，郭 卉 ，仉 伟 ，秦春芝 ，盛晓丹 ，徐怀英 ，刘 霞 ，张 伟 ，秦卓明 ，

（1. 山东省健牧生物药业有限公司，山东济南 250100；2. 济南市动物生物药品工程技术研究中心，山东济南 250100；3. 济南市动物园管理处，山东济南 250031；4. 山东省农业科学院家禽研究所，山东济南 250021；5. 山东省农业科学院畜牧兽医研究所，山东济南 250100）

布鲁氏菌病（brucellosis）是一种人兽共患病，由布鲁氏菌属细菌侵入机体引起。其临床发病特点为长期发热、多汗、关节痛及肝脾肿大等，且可引起人和动物的生殖系统疾病。该病尽管死亡率不高，但可导致人的不孕不育、关节炎等复杂病症，公共卫生意义巨大。由于布鲁氏菌为胞内寄生，敏感抗生素难以进入细胞发挥治疗作用，因此一旦发生布鲁氏菌感染，很难治愈，易造成极其严重的不良后果。目前，对于该病的防控主要依靠疫苗预防和监测净化。

犬是多种布鲁氏菌（猪、牛、羊、犬种）的易感动物。随着犬和人类关系的日益密切，布鲁氏菌由犬传播给人和家畜的风险逐渐升高。目前，我国人畜间布鲁菌病已波及28个省（直辖市、自治区），2017年发病人数高达38 554例。王涛等[1]调查发现，新疆乌鲁木齐市牧区犬布鲁氏菌病总流行率高达41.5%。为客观评价山东省济南市犬布鲁氏菌病流行情况，2016—2017年，对济南市部分辖区的宠物犬和犬场饲养犬采样进行布鲁氏菌分离和抗体检测。

1 材料

1.1 犬血清样品

2016—2017年，在济南市历下区、市中区、历城区、天桥区宠物医院以及槐荫区某种犬场，采集犬血清502份（表1），涉及品种包括雪纳瑞、狼青、西施、泰迪、金毛、比熊、博美、京巴、吉娃娃、拉布拉多、斗牛、牧羊、阿拉斯加以及田园犬、杂交犬等25个品种。犬静脉采集全血，凝固，4 000 r/min离心10 min，收集上清（清亮、无溶血），4 ℃保存。

表1 济南市犬血清采集情况统计

1.2 病料

选择发生过流产的布鲁氏菌血清学阳性雌犬3只，每只犬后肢静脉采集抗凝血1份。冷藏条件下，于采样当天送至中国兽医药品监察所，委托其检测。

1.3 检测试剂

动物布鲁氏菌病竞争ELISA（cELISA）抗体检测试剂盒：抗原为光滑型布鲁氏菌，用于检测猪、牛、羊种布鲁氏菌抗体；布鲁氏菌虎红平板凝集试验抗原（犬种）：抗原为粗糙型布鲁氏菌；布鲁氏菌的标准阴性和阳性血清：中国兽医药品监察所丁家波研究员惠赠。

2 方法

2.1 cELISA抗体检测

2.1.1 加样 取抗原包被板，以1×洗涤液300 μL/孔洗板1次，弃洗涤液；将1:20稀释的待检血清以及阳性和阴性对照血清分别加入ELISA板，50 μL/孔，其中阳性对照和阴性血清各加2孔；加样结束后，加入1:50稀释的单抗，50 μL/孔，振荡混匀5 min，37 ℃作用30 min后取出反应板，弃反应液；每孔加1×洗涤液300 μL，洗涤3次后甩干。

2.1.2 加酶标抗体 将羊抗鼠酶标抗体，用抗体稀释液作1:100稀释后，每孔加入100 μL，37 ℃作用30 min，按2.1.1的方法洗涤3次，甩干。

2.1.3 显色与终止 将底物溶液A和B按1:1（V/V）混合后，立即加入ELISA板中，100 μL/孔，室温避光显色15 min后，每孔加50 μL终止液终止反应；15 min内用酶标仪测定OD450nm值。

2.1.4 结果判定

2.1.4.1 计算公式 抑制率（PI）=（阴性对照OD450nm－样品OD450nm）/阴性对照OD450nm×100%

2.1.4.2 试验成立条件 2个阴性对照血清重复测定孔的平均OD450nm≥2.0，2个阳性对照血清重复测定孔的平均OD450nm＜0.2，且PI平均值≥90%，试验成立。

2.1.4.3 结果判定 血清样本PI≥30%，为布鲁氏菌抗体阳性；血清样本PI＜30%，为布鲁氏菌抗体阴性。

2.2 虎红平板凝集试验（RBPT）

取犬血清和抗原各25 μL，按照《动物布鲁氏菌病诊断技术》（GB/T 18646—2002）方法操作。在阴性、阳性血清对照成立的条件下，对被检血清进行判定。受检血清在4 min内出现肉眼可见凝集现象者，判为阳性；无凝集现象，且呈均匀粉红色者，判为阴性。

2.3 病原分离鉴定

按Betsy等[2]的方法进行犬布鲁氏菌培养，挑取单菌落进行PCR鉴定。

3 结果与分析

3.1 竞争ELISA

在502份犬血清样品中，检出光滑型布鲁氏菌抗体阳性44份。其中，历下区阳性率最高（13.24%），其次是历城区（4.03%）和天桥区（3.53%），市中区和槐荫区最低，未发现感染。在光滑型布鲁氏菌抗体阳性犬中，雌犬占比偏高，为61.36%。在阳性检测结果中，强阳性17份，占比38.64%（表2）。

表2 犬血清光滑型布鲁氏菌抗体检测结果

3.2 虎红平板凝集试验

在502份犬血清样品中，检出粗糙型布鲁氏菌抗体阳性10份，抗体阳性率为1.99%。其中，槐荫区犬场阳性率最高（100%）。在阳性样品中，雌犬和雄犬占比均衡（表3）。

表3 犬血清粗糙型布鲁氏菌（犬种）抗体检测结果

3.3 病原分离鉴定

对发生过流产的布鲁氏菌血清学阳性雌犬采集的3份血液样品，在中国兽药监察所进行病原分离鉴定，结果分离到2株犬种布鲁氏菌，经PCR检测，在272 bp处扩增出预期的IS711片段（图1）。

4 讨论

4.1 检测方法

布鲁氏菌分离是布鲁氏菌病诊断的“金标准”。但PCR方法不失为一种快速、便捷的核酸快速诊断技术，可有效规避繁琐的病原生化实验鉴定，而只需对布鲁氏菌的关键基因，如16S～23S rRNA基因、IS711插入序列和bcsp31基因等鉴定即可。该方法已成为国家标准。此外，PCR对于死亡的病菌仍可检出，这增加了病原确诊的概率。血清学检测是发现布鲁氏菌感染的主要手段，安全性和特异性高，敏感性强。其中，最为快速的定性诊断方法是虎红平板凝集试验和胶体金试纸条检测。这两种方法常用于不同种型布鲁氏菌的初筛。cELISA方法特异性强，灵敏度和准确度高，适用于不同种型布鲁氏菌的大规模监测和确诊；SAT（试管凝集试验）、CFT（补体结合试验）常用于猪、牛、羊种布鲁氏菌的确诊，但操作较为繁琐。

需要强调的是，鉴于布鲁氏菌活菌存在严重的公共卫生威胁，因此不建议在缺乏生物安全的环境下进行病原分离。病原的分离和鉴定应到专业的、具有资质和高生物安全级别的实验室进行，以防止检测人员的意外感染。

图1 犬种布鲁氏菌PCR检测结果

4.2 流行病学

本调查分离到2株犬种布鲁氏菌，说明济南市犬中存在犬种布鲁氏菌流行。研究表明，全国其他地区也存在犬种布鲁氏菌流行。王宁等[3]、周桂兰等[4]、张贺等[5]分别从北京市宠物犬中分离出4株、1株、1株犬种布鲁氏菌。近十年来，四川省[6]、湖南省[7]、内蒙古（锡盟地区）[8]、北京市[3，9]、上海市[10]、新疆（乌鲁木齐市）[1]均开展了犬布鲁氏菌病区域调查，发现犬血清抗体阳性率为0.91%～25.5%。其中：四川省阳性率最低，SAT阳性率为0.91%，RBPT阳性率为10.91%；乌鲁木齐市最高，间接ELISA总体阳性率为25.5%（牧区阳性率高达41.5%）。

本调查发现，济南市犬中流行的布鲁氏菌以光滑型为主。光滑型布鲁氏菌可感染牛、羊、猪等家畜，也可感染人，具有较大的公共卫生威胁。随着宠物犬饲养数量以及人犬密切接触概率的增大，这种潜在危险会逐渐加大，应引起高度重视。类似的犬感染光滑型布鲁氏菌的情况在国内多有发生，如2010—2018年，国内有9个城市先后报道了犬布鲁氏菌病散发病例，大连市13例[11]，新乡市8例[12]，娄底市3例[13]，开封市11例[14]，东莞市[15]、淮安市[16]、丹东市[17]、抚顺市[18]、乌鲁木齐市[19]各1例，多个病例的发生与饲喂羊下脚料有关。

虽然本次调查的光滑型布鲁氏菌抗体阳性率较高，但未分离到光滑型布鲁氏菌，其原因可能与本次采样数量偏少有关；槐荫区犬场的虎红平板凝集试验粗糙型布鲁氏菌抗体阳性率最高，为100%，其原因可能也与样本较少有关（3只），且其中1只雌犬3月前曾发生过流产，为定向采样。后续需要加大采样量，开展系统的流行病学调查和病原分离鉴定，进一步掌握本地犬布鲁氏菌病的真实流行情况。

4.3 防控策略

布鲁氏菌病是我国的人乙类传染病、二类动物疫病，是我国严格控制和净化的病种。调查发现，犬在家畜和人的布鲁氏菌病流行中扮演重要角色，因此需要做好犬的布鲁氏菌病防控，如加强犬布鲁氏菌病科普知识宣传，限制犬的自由活动范围，减少犬与羊、牛、猪的接触，不给犬饲喂生的羊肉、牛肉、猪肉及副产品，定期进行布鲁氏菌血清学检测和犬舍消毒。此外，养犬人应做好个人卫生防护，接触犬后，应及时洗手。一旦发现犬患有长期发热、流产、附睾炎、睾丸炎等布鲁氏菌病症状，应立即隔离，然后委托专业实验室进行布鲁氏菌血清学和病原学确诊。如果确诊感染光滑型布鲁氏菌，就尽快将犬实行安乐死并作无害化处理。对感染粗糙型布鲁氏菌的犬，可选用斯帕沙星、米诺环素、利福平、多西环素、链霉素、阿莫西林/克拉维酸钾、左氧氟沙星等敏感药物[20]配伍使用，隔离治疗3～8周，治愈后对其进行绝育。与病犬密切接触的人员可到省、市级疫控中心采血检测，并采取相应的防范措施。

5 结论

本次调查在山东省济南市5个辖区采集502份犬血样，利用竞争ELISA和虎红平板凝集试验，进行光滑型、粗糙型布鲁氏菌抗体检测，发现抗体阳性率分别为8.76%、1.99%，表明济南市宠物犬中的光滑型布鲁氏菌感染率较高，因而布鲁氏菌通过犬传播给家畜和人的潜在风险较高，需做好犬布鲁氏菌病的综合防控。