雷公藤内酯醇抑制IL-17/TNF-α调节造血干细胞移植后特发性肺炎综合征①

徐小丽 陈焯文 邹 萍

(佛山市第一人民医院血液科，佛山528000)

异基因造血干细胞移植(Allogeneic hematopoi-etic stem cell transplantation,Allo-HSCT)是目前治愈急性白血病、再生障碍性贫血等血液系统疾病的最有效手段[1,2]，但急性移植物抗宿主病(acute graft-versus-host disease，aGVHD)限制了造血干细胞移植的预后[3,4]。肺是aGVHD的重要潜在靶器官，造血干细胞移植后可出现致死性肺aGVHD，表现为发热、咳嗽、呼吸困难，肺功能异常，肺部出现间质性病变及肺泡损伤，组织中有大量淋巴细胞浸润，一旦出现将严重影响患者的生命安全及生活质量[5]。目前预防aGVHD常用的免疫抑制剂为环孢素、他克莫司等[6]，但其长期使用不良反应大、费用高，因此，寻找较小副作用的新型免疫抑制剂，有效改善移植后严重并发症，成为国内外学者研究的重要方向。

雷公藤内酯醇(又称雷公藤甲素，Triptolide，TPL)是从卫矛科雷公藤植物中分离出来的含有 3 个环氧基的二萜内酯化合物，其分子量为360.4，分子式为C20H24O6，它具有抑制多种炎症因子的生成及免疫细胞增殖、诱导细胞凋亡等抗炎和抗肿瘤等作用[7,8]，被认为是器官移植领域中一种很有前景的药物[9]。本研究将其用于小鼠肺aGVHD模型，观察肺组织病理及炎症因子变化，以评价其对肺部aGVHD的防治效果及可能机制。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物 6～8周龄的清洁级雄性近交系纯种C57BL/6小鼠和无特定病原体级(SPF)纯种雌性BALB/c小鼠(体重18.5～22.0 g)，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。

1.1.2主要试剂与仪器 RPMI1640培养基、胎牛血清购于美国Gibco公司；苏木素、醇性伊红购于武汉博士德生物工程有限公司；庆大霉素注射液和红霉素片购于广州白云山制药股份有限公司；小鼠IFN-γ、IL-17、IL-2的ELISA试剂盒购于美国R&D Systems公司；小鼠TNF-α ELISA试剂盒购于美国圣地亚哥的eBioscience公司。双向通风超净台购于苏州净化有限公司；光学显微镜和BX50WI型显微摄影系统购于日本Olympus公司；微量加样器购于德国Eppendoff公司；直线加速器购于德国西门子公司。

1.2方法

1.2.1受鼠的准备 实验受鼠均饲养于华中科技大学同济医学院实验动物中心的SPF级实验室中，采用分笼方式饲养，于移植前1周开始饮用含庆大霉素和红霉素灭菌水；预处理采用直线加速器行全身照射(TBI)，总剂量共为13.0 Gy，为减少受鼠的肠道毒性，总剂量分2次照射，每隔3 h照射1次，照射量率为2.0 Gy/min，照射距离为100 cm。

1.2.2aGVHD模型建立及实验分组 采用麻醉后颈椎脱臼法处死供鼠，乙醇浸泡消毒，无菌操作台下无菌摘取脾脏，充分研磨过滤，收集单个细胞悬液。分离供鼠的股骨，去除两端骨骺暴露骨髓，以1 ml注射器反复冲洗骨髓腔至发白为止，过滤收集细胞液；将上述两种细胞液收集后1 200 r/min离心5 min，裂解红细胞，以磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤2次，调整骨髓细胞和脾细胞比例为1∶4 以诱导出现肺部aGVHD。受鼠在TBI预处理结束的4 h内经其尾静脉输注移植物。实验分组为： C57BL/6小鼠→C57BL/6小鼠，同基因移植组；C57BL/6J→BALB/c，PBS组；C57BL/6J→BALB/c，TPL组，后两组分别指于移植后d0～d7予磷酸盐缓冲液或雷公藤内酯醇液[1 mg/(kg·d)]胃内灌服处理移植后受鼠。

1.2.3aGVHD监测 观察移植小鼠的体重、活动度及弓背、耸毛、腹泻、皮肤脱毛或溃疡等表现，按Cooke的评分系统进行aGVHD评分[10]。

1.2.4存活时间观察 观察移植小鼠是否存活直至移植后d42，绘制Kaplan-Meier生存曲线。

1.2.5组织病理学检测 当移植后受鼠的aGVHD评分≥8分或存活超过42 d，静脉麻醉小鼠后采取仰卧位，逐层分离颈部组织，暴露出气管，用18G套管针插入气管上端，去除针芯，用丝线经气管食管间隙绑扎气管及套管针，使其固定并密封，用质量浓度为40 g/L 的多聚甲醛反复灌注冲洗直至肺组织发白为止，后摘取小鼠的肺组织，多聚甲醛浸泡固定，石蜡包埋，切片，HE染色，光镜下观察肺组织形态学改变，按Delisle标准对肺组织进行组织学半定量评分[9]。随机取同基因移植组受鼠的肺组织为同型对照。

1.2.6肺组织中细胞因子水平 取100 mg肺组织剪碎，加入100 μl PBS充分匀浆，以1 200 r/min离心5 min，吸取上清液，-80℃保存，将样本加入酶标孔，37℃下孵育2 h，加生物素标记的IFN-γ、IL-17、IL-2和TNF-α抗体孵育60 min，洗板并甩干，加显色液，37℃下孵育60 min，洗板并甩干，加入底物避光显色，用酶联免疫吸附试验测定小鼠肺组织中IFN-γ、IL-17、IL-2和TNF-α含量。

2 结果

2.1aGVHD临床表现和生存期 同基因移植组受鼠因全身放疗预处理其食欲下降，在移植第 1周出现短时间体重下降，于2周后体重开始恢复，移植d42小鼠全部存活，受鼠均无弓背、耸毛、脱毛、皮肤溃疡、腹泻、发热、呼吸困难等aGVHD表现；PBS处理的MHC完全不相合移植小鼠组1周内出现重度精神萎靡、耸背、竖毛、毛发脱落、腹泻、血便甚至脱肛，小鼠出现呼吸困难、气促，其aGVHD临床评分在移植后1周明显升高(6.6±0.64)，而后继续升高至小鼠濒死，于移植后d21内小鼠全部死亡；雷公藤内酯醇处理的移植受鼠可出现精神萎靡、活动减少、呼吸稍促等表现，较PBS处理组其症状明显改善，于移植后第2周小鼠出现死亡，d42总生存率为50%(图1A为小鼠生存曲线；图1B为小鼠的aGVHD临床评分)。

图1 受鼠生存率及aGVHD临床评分Fig.1 Survival rate and aGVHD clinical scoreNote: A.Survival for syngeneic,phosphate buffer saline(PBS) and triptolide group；B.Animals were monitored weekly for aGVHD clinical scores.In histograms,data represent the mean and SD.*.P<0.05，**.P<0.01,compared with syngeneic and allogeneic groups.

图2 各组造血干细胞移植术后肺组织病理切片(HE，×200)Fig.2 Pathophysiology of lung injury after hematopoietic stem cell transplantation among different groups(HE,×200)

2.2组织病理学改变 当小鼠aGVHD临床评分>8分或小鼠濒死时，经支气管灌洗固定肺组织，HE染色检测不同组小鼠肺的病理变化。同基因受鼠胸膜腔中未见胸水，肺组织中见少量淋巴细胞，肺泡出血少见； PBS处理组受鼠的肺组织可见大量炎症细胞浸润，血管壁肿胀明显、大量红细胞渗出，肺泡之间间隔变宽及破坏，不少肺组织可见纤维蛋白渗出；雷公藤内酯醇处理组受鼠的肺组织可见炎症细胞浸润，少量红细胞渗出，支气管炎性增生，但程度较PBS处理组明显改善(图2)。

2.3肺组织中细胞因子水平 完全不相合小鼠造血干细胞移植后可出现致死性GVHD改变，PBS处理组小鼠肺组织可出现大量炎症细胞浸润，肺泡出血、组织坏死、纤维蛋白渗出，而雷公藤内酯醇处理组肺损伤明显减轻。为了初步探索雷公藤内酯醇在异基因造血干细胞移植肺组织的免疫保护机制，实验对比了不同肺组织IFN-γ、IL-17、TNF-α和IL-2的水平。结果显示，雷公藤内酯醇处理组，在第1～3周其IL-2水平均未见明显变化(P>0.05)，其肺组织中IFN-γ水平亦未见明显变化(P>0.05)，在第4周PBS处理组受鼠均已死亡，无法获得此时期该组肺组织的IFN-γ水平；在第1周，雷公藤内酯醇处理组肺组织的IL-17与PBS组未见显著性差异，而第2周，经雷公藤内酯醇处理组其IL-17明显下降[TPL(19.2±3.7)pg/ml vs PBS(37.1±4.3)pg/ml，P<0.05]，在第3周其下降程度更显著[(14.7±5.1)pg/ml vs (56.7±1.1)pg/ml]，差异具有统计学意义(P<0.05)；进一步对比了TNF-α在肺组织中的差异，于移植后第1周，经雷公藤内酯醇处理组TNF-α无明显变化；而第2周，雷公藤内酯醇处理组的TNF-α明显下降[TPL(192.7±5.7)pg/ml vs PBS(327.6±11.5)pg/ml，P<0.05]，在第3周，TNF-α下降更显著[(87.1±4.4)pg/ml vs (369.4±15.1)pg/ml，P<0.05](图3)。

图3 各组造血干细胞移植组肺中IFN-γ、IL-17、TNF-α和 IL-2水平(pg/ml)Fig.3 IFN-γ,IL-17,TNF-α and IL-2 determined in lung by ELISA(pg/ml)

3 讨论

异基因造血干细胞移植是治愈血液系统疾病的重要手段，肺部并发症是影响患者疗效的主要因素[11]。广谱抗生素及抗病毒药物的预防性使用，造血干细胞移植术后肺部感染因素所占比重下降，非感染性肺部并发症发病率越来越高。肺为aGVHD的常见靶器官，发生在100 d内的和免疫相关的肺部并发症称为特发性肺炎综合征(Idiopathic pneumonia syndrome,IPS)，是指包括间质性肺炎、闭塞性细支气管炎、闭塞性细支气管炎伴机化性肺炎、弥漫性肺泡出血、围植入期呼吸窘迫综合征、非心源性毛细血管渗漏综合征、迟发性肺毒性综合征和肺细胞溶解性血栓等，临床上主要表现为咳嗽，明显的呼吸困难、有或无发热、低氧血症及肺部弥漫性间质浸润[12,13]。肺aGVHD一旦发生，病情多进展迅速，预后差，死亡率高达50%～74%，无特效的治疗方案[14,15]。

肺aGVHD的发病机制尚不清楚[16]，现认为造血干细胞移植后肺组织损害与局部组织中T细胞分泌的细胞因子相关[17]，其相关的危险因素包括全身照射(TBI)或化疗对组织的损伤，同种异体T细胞的活化和大量的炎性因子产生。目前，“肝-肠-肺”炎性细胞因子轴在IPS中的重要作用越来越受到人们的重视[18]。大剂量放化疗预处理可削弱肠道的黏膜屏障，促进大肠杆菌产生内毒素-脂多糖(LPS)，同时放化疗预处理还可使受者组织释放炎症介质TNF-α和IL-1等，而这些炎症介质可促进受者抗原提呈细胞(MHC)提呈抗原于供者T细胞，并进而激活T细胞，活化后T细胞可向不同T细胞亚群分化，最终释放出相关炎症因子如IFN-γ、IL-2和IL-17等，它们可减弱或促进IPS发生。特发性肺炎综合征在临床上并不常发生，肺属于aGVHD的非经典靶器官，在实验中采用C57BL/6J→BALB/c完全不相合移植模型，移植物中骨髓细胞和脾细胞比例为1∶4，最终诱导出现致死性肺部aGVHD改变，3周内受者全部死亡，证实在特定条件下肺可发生致死性特发性肺炎综合征，与前期研究相一致[19]。进一步研究表明，受者组织损害释放的IFN-γ可激活供者巨噬细胞趋化至肺组织，在LPS刺激作用下可分泌如TNF-α等炎症因子，使炎性细胞趋化至肺组织，最终导致肺组织损伤。而IL-2可刺激供者T细胞的增殖和分化，活化、分化的Th1、Th2、Th17细胞趋化至肺组织，减轻或加剧肺损伤。由此可见，肺组织中细胞因子与造血干细胞移植后特发性肺炎综合征的发生有重要关系，因此，实验检测了造血干细胞移植术后肺组织局部中IFN-γ、TNF-α、IL-2和IL-17水平。在实验中观察到造血干细胞移植后IFN-γ有2个峰值，前者为移植预处理损伤机体组织释放，后者为供者T细胞免疫活化向细胞亚群分化并释放所致，在实验后期，IPS的发生与IL-2、IL-17和TNF-α显著升高有关，这与前期研究有一致性[19]，已有研究表明TNF-α可通过提高肺血管内皮细胞凋亡而促进IPS发生，阻断TNF-α可显著减轻IPS的严重程度。Mauermann等[20]证实产IL-17的Th17细胞在特发性肺炎综合征中发挥重要作用，阻断IL-17或联合阻断TNF-α，可能对治疗特发性肺炎综合征有重要价值。因此，寻求一种低毒、有效并可抑制相关炎症介质的新型免疫抑制剂对指导治疗肺部aGVHD有重要意义。

雷公藤内酯醇(Triptolide，TPL)，是从雷公藤中分离出来的二萜内酯化合物，在体内化学性质稳定，易获得，其生理活性强，具有抑制多种炎症因子生成及免疫细胞增殖，诱导细胞凋亡等作用[21]。雷公藤内酯醇在外周血单个核细胞及小鼠哮喘模型中直接抑制不同细胞因子IL-1、IL-2、IL-4、IL-6、IL-13、IFN-γ和TNF-α的释放[22,23]，Wang[24]和Ying等[25]发现，雷公藤内酯醇可有效阻止 T 细胞增殖和活化而抑制Th17细胞产生因子IL-17。在小鼠骨髓移植模型中,雷公藤内酯醇可显著改善aGVHD发生，其机制与体内脾单核细胞显著减少、CD8+T 细胞增加、D4+T 细胞减少和活化的IL-2受体增加相关[26]。实验采用雷公藤内酯醇处理造血干细胞移植受者，分别检测肺组织局部IFN-γ、TNF-α、IL-2和IL-17水平，实验发现雷公藤内酯醇明显改善移植小鼠生存时间和临床表现，可明显改善毛细血管通透性、红细胞渗出和水肿，伴随着肺组织中IL-17和TNF-α水平明显下降，随着时间延长，雷公藤内酯醇的抑制作用更为明显。实验中经雷公藤内酯醇处理的肺组织其IL-2水平未见明显变化，可能与雷公藤内酯醇明显抑制IL-2受体表达，但对IL-2的产生水平无影响相关，其抑制淋巴细胞增殖是通过影响IL-2和IL-2R相互作用发挥的[27]。

综上所述，异基因造血干细胞移植后可发生致死性特发性肺炎综合征，雷公藤内酯醇可明显改善其发生及进展程度，其免疫机制与降低肺组织内细胞因子IL-17和TNF-α水平相关。但雷公藤内酯醇如何影响肺组织内细胞亚群分布、如何抑制不同细胞因子来调节特发性肺炎综合征的发生和进展等尚需要深入研究。