基于TLR4/NF-κB信号通路探讨通痹胶囊对胶原诱导型关节炎治疗机制的研究①

李宗祥 肖 凯

(华中农业大学医院，武汉430070)

类风湿性关节炎(Rheumatoid arthritis，RA)是一种以小关节为主的慢性关节滑膜炎症、关节软骨和骨组织损伤的自身免疫性疾病，最终引起关节畸形和功能障碍，是使患者丧失劳动力和致残的疾病之一，给患者及其家庭带来极大的痛苦和负担[1-3]。在RA的发展过程中，抗炎因子和促炎因子的平衡是影响患者自身免疫、炎性反应和关节损伤的关键因素。Toll样受体(Toll-like receptors，TLR)是一类广泛表达于不同组织和细胞中的模式识别受体，不仅可以通过识别病原相关分子模式激活天然免疫，还可以通过刺激抗原呈递细胞分泌炎症因子调节获得性免疫[4,5]。髓样分化因子88(MyD88)依赖型TLR信号转导途径可以通过激活转化生长因子β(Transformation growth factor β，TGF-β)和核因子κB(NF-κB)诱导细胞炎症因子白介素-1(Interleukin-1，IL-1)、IL-6、肿瘤坏死因子α(Tumor necrosis factor α，TNF-α)、黏附分子以及干扰素的表达和释放，加重对组织器官的损伤[6-8]。复方通痹胶囊为临床常见的中药复方制剂，有消肿止痛和祛风除湿的作用，广泛应用于风湿以及RA的治疗，但其作用机制的研究仍相对缺乏[9,10]。目前根据造模物质的不同，常见的RA模型有佐剂诱导型关节炎模型(Adjuvant-induced arthritis，AA)、胶原诱导型关节炎(Collagen-induced arthritis，CIA)和胶原抗体诱导型关节炎(Collagen antibody induced arthritis，CAIA)。其中CIA模型的组织和免疫学特征与人类RA的最接近，因此CIA模型广泛用于RA的相关研究中。因此，为了进一步阐明通痹胶囊在RA中的治疗机制，本研究通过建立CIA模型，探究TLR4通路在通痹胶囊治疗RA中的作用机制，为其临床治疗RA提供理论基础。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物 雄性Spraque-Dawley大鼠64只，体重(200±20)g，SPF级，购自湖北省实验动物研究中心。所有大鼠在实验室适应性饲养1周后开始实验。饲养条件为固定光照(12 h∶12 h/白天∶黑夜)，温度(24±2)℃，湿度约30%，自由饮水和进食。

1.1.2实验试剂 通痹胶囊由华中农业大学医院提供，批号：Z10960010。牛Ⅱ型胶原(Collagen Ⅱ,C Ⅱ)、完全弗氏佐剂(Complete fereund′s adjuvant，CFA)、雷公藤购自Sigma公司。4%多聚甲醛和苏木精-伊红染液购自北京艾德莱生物科技有限公司。BCA试剂盒购自ThermoFisher公司。大鼠IL-6、IL-1β、TNF-α ELISA试剂盒购自南京建成生物工程研究所。TLR4(ab13556)、MyD88(ab2064)、NF-κB(ab131546)抗体购自Abcam公司。

1.2方法

1.2.1动物模型制备 实验动物适应性饲养1周后，随机分为正常对照组(Con，8只)和CIA模型组(40只)。将4 g/L的CⅡ型胶原和等量CFA混合均匀并使用均浆器乳化，将制备好的乳剂置于4℃保存备用。CIA模型动物分3点皮内注射CⅡ/CFA乳剂，即背部靠近尾部左右2点分别注射0.2 ml，尾根部注射0.1 ml。7 d后采用同样方法皮下注射0.1 ml CⅡ/CFA乳剂1次。正常对照组动物在相同部位等时间点注射等体积生理盐水。

1.2.2实验动物分组及处理 取造模14 d后成功的大鼠40只，随机分为模型组(Mod)、阳性对照组(雷公藤处理，PC组，0.01 g/kg)、通痹胶囊0.075、0.150、0.300 g/kg剂量组(LD、MD、HD组)。每组8只。处理组以1 ml给药体积/100 g体重灌胃相应药品，每天1次，连续给药14 d。对照组和模型组灌胃相应体积的生理盐水。治疗结束后使用戊巴比妥钠(40 mg/kg)麻醉大鼠，取关节滑膜组织至EP管中保存于-80℃备用；取关节组织固定于4%多聚甲醛溶液中备用。

1.2.3关节肿胀度检测 使用大鼠足踝体积测量仪利用排水法检测大鼠双后足踝体积变化，整个实验过程每7 d测量1次。采用同侧足踝造模前后体积差值为关节肿胀度。

1.2.4HE染色观察关节病理变化 将大鼠关节组织从4%多聚甲醛溶液中取出，并使用梯度浓度乙醇脱水，然后使用二甲苯透明、石蜡包埋、切片；随后使用二甲苯对切片进行脱蜡处理，苏木精染色、1%盐酸、乙醇分化20 s，流水冲洗2 min后使用0.5%伊红染液染色，梯度乙醇脱水透明，封片，普通光学显微镜下观察分析。

1.2.5ELISA检测大鼠血液炎症因子水平 使用尾静脉采血方法采取大鼠血液，4℃静置过夜后，3 500 r/min 离心5 min，取血清检测炎症因子IL-6、IL-1β、TNF-α水平。

1.2.6Western blot检测大鼠关节滑膜组织中TLR4/NF-κB通路相关蛋白的表达水平 取50 mg滑膜组织于2 ml EP管中并加入1 ml含蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液以及2粒玻璃珠，匀浆器匀浆5 min。4℃下12 000 r/min离心15 min，取上清并用BCA蛋白检测试剂盒进行定量。每组取30 μg蛋白进行SDS-PAGE电泳，检测TLR4、MyD88、NF-κB蛋白表达情况，以GAPDH作为定量分子标记物，使用BandScan 5.0软件进行图像分析。

1.2.7回补实验 16只SD大鼠随机分为正常组(Con)、模型组(Mod)、0.300 g/kg通痹胶囊治疗组(Hig)、通痹胶囊联合TLR4激动剂处理组(单磷酰脂质A，Monophosphoryl lipid A，MPLA，HIG+MPLA)，每组4只。实验动物造模以及处理方式参考1.2.1与1.2.2。处理后检测血清炎症因子IL-6、IL-1β、TNF-α水平和滑膜组织中TLR4、MyD88和NF-κB蛋白表达情况。

2 结果

2.1通痹胶囊对大鼠关节肿胀度的影响 采用排水法对各组大鼠关节肿胀度进行检测，结果如图1所示。与正常对照组相比，模型组、阳性对照组和通痹胶囊各剂量组大鼠关节肿胀度均显著升高，且差异具有统计学意义(P<0.05)。与模型组相比，阳性对照组和通痹胶囊高剂量组治疗7 d和14 d后的关节肿胀度显著降低(P<0.05)。

2.2通痹胶囊对模型大鼠关节病理的影响 如图2所示，正常对照组大鼠可见滑膜细胞排列整齐且无增生，血管分散分布，关节腔无渗出物，无浸润的单核和淋巴细胞，关节表面光滑。模型组滑膜组织增生明显，炎症细胞浸润，组织内可见新生毛细血管增多以及散在分布的尚未形成管腔结构的毛细血管，形成关节软骨的破坏。阳性对照组和通痹胶囊高、中剂量用药组治疗后不同程度地抑制了滑膜组织的增生，降低炎症细胞的浸润。

图1 大鼠关节肿胀度变化Fig.1 Changes of joint swelling in ratNote: Mean SD.n=6.*.P<0.05 vs CON group;#.P<0.05 vs MOD group;▲.P<0.05 vs PC group;△.P<0.05 vs LD group.

图2 HE染色观察大鼠关节组织病理变化Fig.2 Observation of histological changes of rat arthritis tissues by HE stainingNote: A.Control group;B.CIA model group;C.Positive control group;D.Tongbi capsule low dose group;E.Tongbi capsule middle dose group;F.Tongbi capsule high dose group.Arrow.Damage in cartilage;oval.damage in synovial.

2.3通痹胶囊对模型大鼠血清炎症因子IL-6、IL-1β和TNF-α水平影响 各组大鼠处理后血清炎症因子IL-6、IL-1β和TNF-α水平如图3所示。与正常对照组比较，模型组大鼠血清中IL-6、IL-1β和TNF-α水平均显著升高(P<0.05)。与模型组比较，阳性对照组和通痹胶囊高剂量组血清中IL-6、IL-1β和TNF-α水平显著降低(P<0.05)。实验结果表明0.3 g/kg通痹胶囊处理14 d能显著降低CIA大鼠血清炎症因子的水平，从而降低炎性反应水平。

2.4通痹胶囊对模型大鼠滑膜组织中TLR4、MyD88、NF-κB蛋白表达影响 本研究使用Western blot检测各组大鼠滑膜组织中TLR4、MyD88和NF-κB的蛋白表达情况，结果如图4所示。与正常对照组比较，模型组大鼠滑膜组织中TLR4、MyD88和NF-κB水平均显著升高(P<0.05)。与模型组比较，阳性对照组和通痹胶囊中、高剂量组滑膜组织中TLR4、MyD88和NF-κB水平显著降低(P<0.05)，且阳性对照组显著低于通痹胶囊处理组。

2.5激活TLR4/MyD88信号通路可以抑制通痹胶囊对CIA大鼠的治疗作用 为了验证通痹胶囊可以通过抑制TLR4/MyD88信号通路发挥对CIA的治疗作用，本研究使用通痹胶囊联合TLR4/MyD88激动剂MPLA处理CIA大鼠。结果发现，MPLA处理后显著降低通痹胶囊对TLR4、MyD88和NF-κB蛋白表达的抑制作用，提高TLR4、MyD88和NF-κB的蛋白表达水平，见图5。且激活TLR4/MyD88通路以后大鼠血清炎症因子IL-6、 IL-1β、 TNF-α水平显著高于通痹胶囊单独处理组，见图6，说明通痹胶囊可以通过抑制TLR4/MyD88信号通路治疗RA。

图3 大鼠血清中IL-6、IL-1β、TNF-α水平变化Fig.3 Levels of IL-6，IL-1β and TNF-α in rat serumNote: CON.Control group;MOD.CIA model group;PC.Positive control group;LD.Tongbi capsule low dose group;MD.Tongbi capsule middle dose group;HD.Tongbi capsule high dose vs CON group;#.P<0.05 vs MOD group;▲.P<0.05 vs PC group;△.P<0.05 vs LD group.

图4 大鼠滑膜组织中TLR4、MyD88和NF-κB蛋白表达水平Fig.4 Protein levels of TLR4，MyD88 and NF-κB in rat synovial tissuesNote: CON.Control group;MOD.CIA model group;PC.Positive control group;LD.Tongbi capsule low dose group;MD.Tongbi capsule middle dose group;HD.Tongbi capsule high dose vs CON group;#.P<0.05 vs MOD group;▲.P<0.05 vs PC group;△.P<0.05 vs LD group.

图5 抑制TLR4通路对大鼠滑膜组织中TLR4、MyD88和NF-κB蛋白表达水平的影响Fig.5 Effect of protein expression of TLR4，MyD88 and NF-κB in rat synovial tissues by inhibited TLR4 pathwayNote: CON.Control group;MOD.CIA model group;HD.Tongbi capsule high dose group;HIG+MPLA.Tongbi capsule high dose combine with TLR4 agonist vs CON group;#.P<0.05 vs MOD group;▲.P<0.05 vs HIG group.

图6 抑制TLR4通路对大鼠血清中IL-6、IL-1β和TNF-α水平影响Fig.6 Effect of serum levels of IL-6，IL-1β and TNF-α in rat by inhibited TLR4 pathwayNote: CON:control group;MOD:CIA model group;HD:Tongbi capsule high dose group;HIG+MPLA:Tongbi capsule high dose combine with TLR4 agonist vs CON group;#.P<0.05 vs MOD group;▲.P<0.05 vs HIG group.

3 讨论

RA是一种致病机制较为复杂且难以治愈的自身免疫性疾病，其发病机制尚未完全明确，因此至今尚无特效疗法[11]。疼痛和炎症是RA的两大主要症状，现行RA的治疗也是通过减轻关节组织的炎性反应，达到修复关节损伤、降低痛疼、缓解症状的目的[12]。本研究结果发现，通痹胶囊能够通过抑制TLR4/NF-κB信号通路减轻胶原诱导的大鼠关节组织损伤，以及降低大鼠血清中炎症因子IL-6、IL-1β和TNF-α的水平。

RA患者病灶局部发生T细胞浸润，大量分泌IL-6、IL-1β和TNF-α等炎症因子。IL-1β可以通过刺激淋巴细胞释放细胞因子，刺激滑膜细胞和软骨细胞释放金属蛋白酶和机制溶素，破坏软骨基质[13]。IL-6作为一种促炎因子可以通过增加IL-1β和TNF-α的一些生物效应的放大因子，诱导肝脏合成类风湿因子[14]。RA属于中医“痹症”范畴，是由于风、寒、湿和热等外邪侵袭人体导致的麻木、屈伸不利和关节肿大等症状。通痹胶囊具有解表除湿、祛风散寒、活血化瘀、抗炎和镇痛的作用[15]。本研究结果发现，0.300 g/kg通痹胶囊治疗14 d后大鼠关节滑膜组织损伤显著减轻，且炎症因子IL-6、IL-1β和TNF-α水平也显著降低，说明通痹胶囊能够显著抑制CIA大鼠的炎性反应，减轻炎症损伤。吴德松等[16]研究也证实通痹胶囊具有明显的镇痛以及抗RA活性。王晓磊等[9]在治疗RA的临床研究中也发现通痹胶囊对于改善RA患者的关节功能具有良好疗效，且能够显著降低患者外周血中IL-1β、IL-6和TNF-α的水平。

TLR是一类启动天然免疫的细胞表面信号传导受体蛋白，在自身免疫疾病中发挥重要作用。TLR4是天然免疫系统识别病原体的主要受体，广泛表达于上皮细胞、内皮细胞以及免疫细胞表面，与慢性炎症、自身免疫疾病以及肿瘤的发生相关。TLR4可以通过MyD88依赖和MyD88非依赖信号转导途径激活细胞内信号转导，诱导NF-κB活化，从而活化炎性反应，引起IL-6、IL-1β和TNF-α等炎症因子的释放，诱导级联炎性反应[17]。本研究结果显示，通痹胶囊治疗后大鼠关节组织中TLR4、MyD88和NF-κB蛋白水平显著降低，说明通痹胶囊显著抑制TLR4/NF-κB信号通路的激活，从而抑制炎症因子的释放，改善RA症状[18]。此外，我们还发现激活TLR4/NF-κB信号通路以后能够显著抑制通痹胶囊诱导的炎症因子IL-6、IL-1β和TNF-α水平降低。

综上所述，本研究以胶原诱导型RA模型为基础，通过病理学观察和免疫学检测，证实通痹胶囊可以通过抑制TLR4/NF-κB通路的异常激活，降低炎症因子的释放，显著改善RA的炎性反应。