NLR及ESE-3转录因子在胃癌患者中表达及其与预后的关系

李玲玲 杨俊娥 石庆芳 杜秋越 王大庆 周风举

(1哈励逊国际和平医院肿瘤科，河北 衡水 053000；2天津市中心妇产科医院病理科)

胃癌是最常见的上消化道恶性肿瘤，2015年癌症统计数据〔1〕显示，我国胃癌患者67.9万例，仅次于肺癌，且死亡率极高，我国胃癌死亡人数占全球同期胃癌总死亡40%以上〔2〕，为社会及家庭带来严重的疾病负担。ETS超家族是一个转录调控因子家族，在肿瘤演进过程中发挥重要作用〔3〕，上皮转录调控因子(ESE)-3转录因子作为 ETS 家族的一员，主要调控基因表达，ESE-3在胰腺癌、卵巢癌中作为抑癌因子，抑制肿瘤细胞的增殖〔4,5〕，在甲状腺癌中则作为促癌基因直接作用于HER2和 HER3结合位点，促进肿瘤的进展〔6〕。ESE-3表达异常与胃癌关系如何，国内外相关报道很少。此外，中性粒细胞和血小板积极参与肿瘤进展和转移过程，中性粒细胞淋巴细胞比值(NLR)和血小板与淋巴细胞比率(PLR)与多种恶性肿瘤预后密切相关〔7〕，但关于胃癌术后预后相关研究较少。本研究分析胃癌组织ESE-3、CD133及NLR、PLR与患者临床病理特征相关性，再探讨NLR及ESE-3转录因子对胃癌患者预后的影响。

1 资料与方法

1.1病例来源 选择2011年5月至2013年5月哈励逊国际和平医院初次行胃癌根治术患者82例，研究对象均符合纳入标准。纳入标准：①初次行胃癌根治术；②术后病理组织确诊为胃癌，根据国际抗癌联盟/美国癌症联合委员会(UICC/AJCC)胃癌 TNM 分期标准(2010)进行术前分期；③患者及家属了解并签署之情同意书。排除标准：①术前未进行化疗；②术前合并严重感染或免疫性疾病；③年龄大于75岁。术后通过复诊、电话、邮件等形式进行随访，随访时间终点为术后5年，随访终点时间为患者死亡，以随访结束或术后至死亡作为患者生存时间，本研究已通过医院伦理委员会伦理审查。

1.2研究方法 免疫组化SP检测法：取胃癌病灶及距原发灶边缘 5 cm 以上的正常胃黏膜组织，标本送病理科石蜡包埋，熟练切片厚度为5 μm，切片放恒温箱收集备用，经脱蜡水化放入EDTA修复液灰盒，在高压锅中加热到喷气1.5 min，取出后放入 3%的过氧化氢溶液中，室温避光10 min，经PBS溶液洗涤3 次，每次5～10 min，将一抗用抗体稀释液稀释，ESE-3抗体(Abcam 公司，英国)及CD133 抗体(Miltenyi 公司，德国)稀释后，次日复温后滴加二抗 ，37℃孵育30 min后，加 PBS洗涤3次每次5～10 min，滴加新配置的二氨基联苯胺(DAB)显色，显微镜下观察直至颜色变为黄褐色，苏木精复染2～5 min，脱水，透明，使用中性树胶封片。有棕褐色或棕黄色着色颗粒记为阳性。随机选取观察区域内5个高倍视野，每个高倍视野计数500个细胞，其阳性细胞百分比<5%者判为阴性，≥5%为阳性。研究对象术前1 w内采集静脉血2 ml，进行血常规检测，包括淋巴细胞计数、中性粒细胞计数、血小板计数等，计算NLR及PLR。以 NLR<4 为低NLR组，NLR≥4 为高NLR组；PLR<195为低PLR组，PLR≥195为低PLR组〔8〕。

1.3统计学处理 采用SPSS19.0软件进行χ2检验，采用Kaplan-Meier法制作生存曲线，组间生存曲线比较采用Log-rank检验。

2 结 果

2.1ESE-3、CD133在胃癌及癌旁组织中的表达 胃癌组织中ESE-3阳性表达为81.7%(67/82)，显著高于癌旁组织(54.9%，45/82)，差异有统计学意义(χ2=13.629,P=0.000)，阳性颗粒主要定位于细胞核中。胃癌组织中CD133阳性表达为51.2%(42/82)，癌旁组织均为阴性，两组差异具有统计学意义(χ2=56.459,P=0.000)。

2.2ESE-3、CD133表达与胃癌患者临床病理特征的关系 胃癌组织ESE-3表达阳性率与患者TNM分期及浸润深度明显相关(P<0.05)，而与患者性别、年龄、肿瘤大小、分化程度、淋巴结转移无相关(P>0.05)；胃癌组织CD133表达阳性率与患者肿瘤分化程度、TNM分期及浸润深度明显相关(P<0.05)，而与患者性别、年龄、肿瘤大小、淋巴结转移无相关(P>0.05)，见表1。

表1 ESE-3、CD133阳性表达与患者临床病理特征的相关性(n,n=82)

2.3NLR、PLR与胃癌患者临床病理特征的关系 胃癌患者NLR高水平与患者分化程度、TNM分期及浸润深度明显相关(P<0.05)，而与患者性别、年龄、肿瘤大小、淋巴结转移无相关(P>0.05)；胃癌患者PLR高水平与患者肿瘤分化程度、TNM分期及浸润深度明显相关(P<0.05)，而与患者性别、年龄、肿瘤大小、淋巴结转移无相关(P>0.05)，见表2。

表2 NLR、PLR与患者临床病理特征的相关性(n,n=82)

2.4NLR及ESE-3转录因子与胃癌患者临床预后的关系 胃癌组织中ESE-3转录因子表达阴性患者其术后生存情况显著优于ESE-3表达阳性患者(P<0.05)，见图1；NLR低水平患者其术后生存情况显著优于NLR高水平患者(P<0.05)，见图2。

图1 ESE-3表达与胃癌患者临床预后的关系

图2 NLR与胃癌患者临床预后的关系

3 讨 论

早发现早治疗是减少胃癌死亡率的最有效措施。近年来，胃癌相关生物学标志物研究为其预防和治疗提供了重要依据，其中ETS超家族已被证实在细胞增殖分化、凋亡及肿瘤形成过程中起着至关重要的作用〔9〕。ESE-3转录调控因子属于 ETS超家族的 ESE亚家族，广泛存在于细胞核内，能够单独或与其他效应分子形成转录复合物，抑制或增强不同下游靶基因转录。大约85%的肿瘤是由腺上皮组织中基因异常表达导致上皮细胞增殖和分化缺陷发展而来，ESE-3在上皮或在富含腺上皮组织中表达异常促进了肿瘤的发生、发展〔10〕。在结肠癌、胰腺癌等恶性肿瘤中，ESE-3是一种潜在的肿瘤抑制基因，其在癌组织中表达明显低于癌旁组织〔11〕；而在甲状腺癌中证实ESE-3上调频繁，增强了癌细胞增殖及运动性和侵袭能力。本研究结果显示，胃癌组织ESE-3阳性表达高于癌旁组织，可能是胃癌新的转录因子。Shi等〔12〕发现敲低胃癌细胞ESE-3表达可显著抑制ETS蛋白质的关键靶点基质金属蛋白酶家族基因的表达，此外，下调胃癌细胞ESE-3表达可降低her2～4 mRNA表达，抑制其下游MAPK/ERK和PI3K/AKT信号通路活性酶家族来促进胃癌的发生。因此，ESE-3可能成为胃癌预后判断新指标，为基因治疗提供新靶点。

肿瘤发生发展与机体炎症细胞和免疫信号密切相关〔13〕，其中中性粒细胞、淋巴细胞和血小板尤为重要。肿瘤细胞通过调节炎症基因释放促炎因子和趋化因子，抑制细胞免疫并促进癌细胞生长；中性粒细胞通过生成多种炎症介质，促进肿瘤血管形成及转移扩散，并减弱自然杀伤细胞功能，促使肿瘤细胞免疫逃逸。 淋巴细胞是抗肿瘤免疫主要细胞，淋巴细胞数量减少为肿瘤细胞增殖及恶性侵袭提供了条件。NLR可反映肿瘤患者炎性反应和免疫反应平衡状态，高水平NLR 有利于肿瘤细胞增殖转移，Zhao等〔14〕通过回顾性分析378 名恶性肿瘤患者NLR与临床病理特征及生存率的关系，发现NLR 为进展期恶性肿瘤患者预后的独立危险因素。PLR则反映与肿瘤细胞相关的炎症反应，肿瘤细胞增殖诱导IL-1、IL-6水平增加，致使血小板过度增生，进而释放因子促进肿瘤细胞生长。本研究发现胃癌患者NLR及PLR 水平与年龄、性别、肿瘤大小、淋巴结转移无关，与肿瘤分化程度、TNM分期及浸润深度有关，且低水平NLR胃癌患者生存期优于高水平患者。这可能与机体免疫和炎症反应失衡，肿瘤细胞浸润转移增加，抑制肿瘤细胞增殖作用减弱有关，Sun等〔15〕通过回顾性分析305例胃癌根治术患者NLR、PLR等相关指标，认为其能有效评价患者总生存率；Lee等〔16〕研究显示NLR和PLR 是晚期胃癌化疗患者预后的独立危险因素。因此，胃癌根治术患者术后监测NLR及PLR 水平，在一定程度上可反映其预后水平。

综上所述，NLR及ESE-3表达与胃癌发生发展及预后密切相关，ESE-3可能是胃癌一种潜在的预后标志物和治疗靶点。但ESE-3在胃癌组织中上调，促进胃癌发展的机制有待进一步研究，为临床药物治疗提供新的思路。