隐匿性乙型肝炎病毒发生分子机制的研究进展

张莉　邱艳

[摘要] 隐匿性乙型肝炎病毒感染（OBI）指用高灵敏度的核酸检测可在HBsAg阴性感染者肝组织中检测到HBV DNA。本文介绍了OBI形成的基因分子机制：s、p、x和c基因的开放阅读框突变、起始密码子和终止密码子突变;基因调控序列突变影响转录过程及转录后调控;表观遗传调控。目前OBI个体HBV复制、基因表达过程中的表观遗传调控研究尚处于起步阶段，研究前景广阔。此外，本文对欧洲、南非、东南亚以及中国献血者OBI形成的基因分子生物学机制进行了梳理和汇总。

[关键词] 隐匿性乙型肝炎病毒感染;乙肝表面抗原;乙肝表面抗体;基因分子机制;表观遗传调控;献血者

[中图分类号] R575.1          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-7210（2019）06（b）-0023-05

Advance of molecular mechanism of occult hepatitis B virus

ZHANG Li   QIU Yan

Beijing Red Cross Blood Center， Beijing   100088， China

[Abstract] Occult hepatitis B virus infection （OBI） means that HBV DNA can be detected in liver tissues of HBsAg negative infected people with highly sensitive nucleic acid detection. This paper introduces the gene molecular mechanism of OBI formation： open reading frame mutation， initiation codon and termination codon mutations of s， p， x and c genes; effect of mutations of gene regulatory sequences on transcriptional processes and post-transcriptional regulation; epigenetic regulation. At present， the studies on epigenetic regulation during the process of HBV replication and gene expression in OBI individuals are still in its infancy， with broad research prospect. In addition， this paper summarizes the gene molecular mechanisms of OBI formation in blood donors of Europe， South Africa， Southeast Asia and China.

[Key words] Occult hepatitis B virus infection; Hepatitis B surface antigen; Hepatitis B surface antibody; Gene molecular mechanisms; Epigenetic regulation; Blood donors

隱匿性乙型肝炎病毒感染（occult HBV infection，OBI）指现有血清学技术检测HBV感染者乙肝表面抗原（HBsAg）阴性，用高灵敏度的核酸检测方法在血清和/或肝组织中可检测到HBV DNA。早期研究认为OBI形成可能的原因有：①e抗原血清学转换后，在长期的病毒无复制期检测不到HBsAg;②由于HBV基因发生变异，导致HBsAg无法合成或无法通过血清学检测方法检测;③其他病毒（HDV、HCV）合并感染干扰HBV的复制[1]。本文在基因水平简述OBI形成的分子机制。

1 HBV基因组的基本构成

HBV基因组DNA是长约3.2 kb的环状、部分双螺旋结构，包含编码包膜蛋白（S）、核壳（C）、聚合酶（P）及X蛋白的4个高度重叠的开放阅读框（open reading frame，ORF）。见图1。s基因上游的前-s1、前-s2和c基因上游的前c基因可通读翻译S1、S2蛋白和C蛋白相关抗原。调控基因组复制和转录的调控序列位于编码基因内部，启动子（promoter）序列尚不清楚，增强子（enhancer，ENH）位于p基因中;polyA附加信号位于c基因ORF中。

根据全部核苷酸序列的差异≥8%将HBV分为A～I 9个基因型[2]，同一基因型内又有不同基因亚型。HBV基因型呈地理区域性分布，在不同人种中流行及传播方式各异。

2 OBI形成的分子机制

2.1 基因突变与OBI的形成

2.1.1 s基因主要亲水区（major hydrophilic region，MHR）的突变  OBI血清中缺乏可检测到的HBsAg，HBV s基因中MHR序列突变引起HBsAg表达和分泌减少是造成这种现象的原因之一。MHR位于HBsAg膜外区的99～169位氨基酸区域。其124～147位氨基酸序列相对保守，称为“a”抗原决定簇（“a”determinant）[3-4]。MHR是中和抗体作用的主要靶区域，对HBsAg抗原性具有重要意义。研究发现，OBI个体S蛋白突变可发生于“a”抗原决定簇126、129、130～134、141、142、144和145氨基酸位点，其中G145R最常见。其两侧其他突变如Q101R/H、E164D等均可能与OBI发生有关[5-6]。Lusida等[7]报道HBV S蛋白的a决定簇区域可检测到T126I、T123A、M133L和T143M氨基酸替换。Bes等[8]分析24例HBV/D OBI献血者的s基因、前s基因、前c/c抗原基因，发现s基因突变频率明显比c基因高，且突变多集中在MHR。Rastegarv等[9]报道感染HBV/D（ayw）亚型血液透析患者的S蛋白区域存在T127P、P153L和F170S氨基酸位点的突变或者替换。Liao等[10]扩增并测序OBI献血者的preS/S基因，MHR中OBI相关的S蛋白突变（S117T、T118K、T131N、T134Y/L和D144E）发生率显著高于对照组（慢性乙肝患者）（51.16%比12.96%，P < 0.01），且这些突变往往“共”存在。另外，OBI标本中还检测到>33个碱基对的preS缺失。涂东晋等[11]扩增10例（10/66）OBI标本的s基因序列，其中7例S区氨基酸发生突变，6例突变发生在“a”抗原决定簇及周边MHR。王晓存等[12]在33例s基因阳性OBI样本中发现9例MHR氨基酸发生了变异，发生频率由高到低依次为T143S、I110L、S113T、T126I、K122R、K160R、F134Y和K159G。以上研究结果提示，MHR突变在很大程度上决定了HBV的隐匿性感染。

2.1.2 其他基因ORF的突变  Kim等[13]选取10例韩国特有的HBVC型大表面蛋白（LHBs）突变体进行序列分析，发现KD（W36L、T47K、N52D）等5例氨基酸突变位于MHR之外，且为OBI个体特有。这些突变在很大程度上影响了HBsAg胞内和胞外的分泌。Rendon等[14]报道在晚期肝病OBI患者中编码P蛋白的重叠序列发生改变以及Q219R突变，后者提示了A2915G突变在OBI发病机制中的作用。HBV X蛋白是体内和体外病毒复制所必需的，x基因部分缺失和起始密码子突变均可导致病毒OBI状态。Kim等[15]在6例接种过HBV疫苗的OBI病例中检测到共同的突变类型（X8Del），即HBV X基因（HBxAg）的C末端区域有8个碱基对缺失。进一步体外和体内分析表明，与野生型比较，X8Del HBxAg变异体减少了HBsAg和HBV病毒粒子的分泌，这可能是导致HBV疫苗接种者隐匿性感染的原因。Fujise等[16]发现OBI病例中x基因起始密码子ATG（蛋氨酸）突变为GTG（缬氨酸），且A1762T和G1764A发生核苷酸交换。HBV c基因ORF编码核心蛋白和HBeAg。Chamni等[17]报道泰国OBI献血者C区的突变（65%）位于基础核心启动子区域（A1762T / G1764A）和前核心区域（G1896A）。

2.2 HBV基因调控序列突变影响转录过程及转录后调控导致OBI形成

基因突变包括点突变、基因片段的插入或者缺失等。Chen等[6]首次报道了1例OBI患者前s/s基因区域的13种突变，涉及核苷酸缺失、插入以及前s1和前s2起始密码子的突变。与野生型比较，这13种新型核苷酸突变体的HBsAg表达水平降低了51.2%～99.9%，前s1区域3046～3177缺失突变体造成病毒复制能力和表面抗原启动子Ⅱ活性分别下降了43.3%和97.0%。Candotti等[18]报道，发生在B型和C型OBI中的前s2/s剪接体位点的突变可影响pre-s2/s mRNA剪接，造成HBsAg分泌受限。Wei等[19]报道X基因的突变可发生在复制调控元件、BCP和增强子Ⅱ。Biswas等[20]分析OBI献血者的基础核心启动子（BCP）和前核心蛋白（Pre-C）突变，发现BCP区域常见的6～8种核苷酸突变（1752～1773及1814核苷酸）。Rendon等[14]报道HBx、HBeAg、HBcAg和核心蛋白启动子的突变（A1762T、G1764A、C1766T和T1768A）。

陈静娜等[21]从OBI献血者样本中扩增得到c区突变基因转染Hu H7细胞和注射Balb/c小鼠，检测HBcAg和HBeAg的表达水平。与野生型比较，c区突变型显著性下调HBeAg和HBcAg的表达水平，形成OBI。刘妍等[22]为分析HBV s基因MHR的N-糖基化突变与OBI发生机制的关系，设计系列实验证实MHR区N-糖基化突变造成的HBsAg抗原性降低是引起OBI原因之一。

由于HBV基因的高度重叠，核苷酸位点和/或基因片段的缺失、插入或者突变以及翻译后蛋白的修饰突变往往不仅造成一个蛋白基因的转录或者转录后调控无法正常进行，还会影响相邻蛋白甚至几个蛋白的合成或者空间结构形成受阻，这些直接或者间接导致OBI的形成。由于OBI个体主要表现为HBV粒子表面HBsAg表达障碍，因此对s基因序列分析以及调控研究历时已久并且较为深入。但隨着分子生物学技术的进步，OBI的形成还不仅仅局限在基因的突变和转录调控方面。

2.3 表观遗传调控与OBI的形成

除了基因突变，HBV病毒复制和基因表达受到抑制也是OBI形成的重要原因。DNA甲基化是一种常见的细胞防御机制，可致入侵的外源DNA或者病毒基因组静默。HBV基因组中有3个CpG岛，分别分布在s基因ATG翻译起始区（CpG岛-Ⅰ）、x基因启动子的增强区（CpG岛-Ⅱ）和p基因ATG翻译起始区（CpG岛-Ⅲ）。在HBV感染的肝癌患者（HCC）和肝细胞样本中发现CpG岛-Ⅰ和Ⅲ都存在甲基化。Vivekanandan等[23]研究发现A型HBV DNA可以在人体组织中甲基化，进而调控基因的复制和表达。Kaur等[24]发现HCC组织中HBV基因组的CpG岛-Ⅰ经常发生甲基化，这可能与肝癌的发展相关。Vivekanandan等[25]分析5例OBI的全长基因序列发现OBI个体HBV基因CpG岛-Ⅱ的甲基化较CpG岛-Ⅰ明显密集，这与HBV阳性对照组的情况恰恰相反。

HBV共价闭合环状DNA（cccDNA）是HBV循环复制的中间体，也是OBI形成的分子基础。cccDNA可结合组蛋白和非组蛋白形成稳定的小染色体（minichromosomes）。免疫沉淀反应显示在siRNA、去乙酰化酶和/或药物诱导下，cccDNA结合的H3和H4组蛋白的乙酰化状态可以调控HBV的复制和转录[26]。表观遗传调控对HBV复制、转录以及影响OBI形成的研究尚处于起步阶段。

3 献血人群OBI HBV基因的研究

1978年，Hoofnagle等[27]首次报道OBI献血者传染HBV。Sosa-Jurado等[28]在墨西哥HBV/H的OBI献血者样本中检测出“a”抗原决定簇的多种突变。Kishk等[29]报道HBV/D OBI献血者样本中Q129R突变明显高于HBV显性感染组（P = 0.01），而后者S143L/T和P120T/S氨基酸替换比例高于前者。另有研究报道，在病毒载量很低（<50 copies）的E型OBI献血者样本中，聚合酶基因逆转录酶结构域的L217R多态性显著高于HBsAg阳性对照组（P < 0.0001）[30]。Liao等[10]、Biswas等[20]扩增并测序OBI献血者的preS/S基因、前核心蛋白（Pre-C）得到多种核苷酸突变。Candotti等[18]报道，东南亚HBV B（60%）或C型（34%）OBI献血者中，pre-S2/S剪接体周边突变普遍存在[B型（44%）和C型（36%）]。细胞转染试验中这一突变使HBsAg粒子分泌减少。剪接体的缺失突变可能是东南亚献血者OBI形成的主要原因之一。

1992年新生兒乙肝疫苗接种计划实施后，至2006年我国人口的乙肝流行率仍为7.18%[31]。人群HBV的高流行率造成OBI在献血人群中较高的流行率。OBI献血者仍然是影响我国输血安全的潜在威胁。

Zhang等[32]用3个OBI献血者的MHR代表性突变构建重组质粒转染HepG2或Huh7细胞。之后检查HBsAg的表达和抗原性。与野生型毒株比较，胞外上清液和细胞内HBsAg水平均降低明显。OBI相关突变引起的抗原性降低是HBsAg不易检测到的主要原因。王东等[33]报道大连地区OBI献血者以HBV/C为主，其次为HBV/B。扩增其前s/s基因序列，获得HBV/C的氨基酸变异多集中在118、127、164等区域，HBV/B的变异多集中在161、168、217区域。赵亮等[34]报道，福州OBI献血者中HBV/B是主要流行病毒株（15/16），对HBV/B的s基因测序发现，MHR氨基酸的变异多集中在“a”抗原决定簇（25/33），变异的形式主要为单个氨基酸点替换，OBI组变异率高于对照组（HBsAg+/HBV DNA+）。另有7例标本在124位与125位氨基酸的密码子间发生了9个碱基的非移码插入，造成该位点“TNR”3个氨基酸的插入。蒋菲菲等[35]分析安徽、福建、江西三地血液中心OBI献血者s基因变异情况，报道35例OBI标本扩增产物中，74.3%（26/35）出现HBV s基因MHR区氨基酸置换突变，主要集中在“α”抗原决定簇区域。

叶贤林等[36]报道经HBsAg及NAT检测合格的抗-HBc（+）献血者，其血液中仍有一定概率含有HBV DNA，存在经输血传播病毒的威胁。因此，输血之前对献血者OBI的筛查十分必要。

4 小结

当前，HBV仍然是输血安全领域的焦点之一，表面健康、无症状献血者中较高的OBI流行率需要特别关注。HBV编码基因、调控序列的突变以及表观遗传调控对病毒隐匿性特征形成的分子机制研究对保障输血安全、临床诊断和HBV流行病学监控具有重要意义。目前，在没有抗-HBc检测的情况下，NAT单检是最为准确的OBI检测[37]。然而，灵敏度更高的检测技术可有效降低免疫学检测合格献血者中OBI的流行率，基于基因水平的、针对不同基因型、不同核苷酸突变的分子生物学检测方案的建立十分必要。

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