基于Bcl-2/Beclin-1复合体探讨黄连素对脑缺血再灌注损伤大鼠模型的保护作用

丁实，赵学荣，李宝群，赵亮，周健，毕红东，庞冲，郭娜娜

(1.承德医学院药理学教研室，承德 067000;2.承德医学院免疫学教研室，承德 067000)

缺血性脑卒中属于常见的脑血管疾病，占脑血管疾病的60%以上，近年来发病率逐渐升高，给患者的家庭和生活质量带来了严重的影响[1]。患者脑缺血后引起的炎症反应、自噬、细胞坏死、钙超载等多种原因进而导致脑损伤，加重病情并影响患者的预后[2]。脑缺血过程中自噬具有双重作用，适度自噬清除受损、衰老细胞，对神经细胞主要起保护作用，过度自噬则导致细胞死亡增加，加重脑损伤[3]。Beclin是一种特异性的自噬调节基因，可与配体结合激活自噬活性[4]。研究报道自噬与凋亡两种细胞死亡方式存在相互调节作用，B细胞淋巴瘤/白血病-2(B cell lymphoma/lewkmia-2，Bcl-2)等凋亡蛋白可结合beclin蛋白激活自噬活性，调控细胞的自噬[5]。黄连素(berberine，Ber)是从黄柏等植物中提取出来的生物碱，具有抗菌、抗心律失常、抗肿瘤等多种作用，对脑缺血、老年痴呆、焦虑等神经细胞具有保护作用[6]。然而关于黄连素对脑损伤中细胞自噬的作用尚不清楚，本研究通过制备大鼠脑缺血再灌注模型，观察黄连素对大鼠神经细胞的保护作用及对细胞自噬的影响，以期探究黄连素的可能保护机制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

SPF级雄性SD大鼠108只，8周龄，体重200 ～ 260 g，由郑州大学动物实验中心提供【SCXK证号2017-0002】，在承德医学院动物实验室进行实验，所有实验动物均严格按照动物饲养规则喂养，本研究中经河北省承德市动物伦理委员会批准同意，批号为IACUC-01(20180917)。

1.1.2 主要试剂及仪器

黄连素原粉(哈尔滨三精制药厂，中国)；尼莫地平(Nimodipine，NMDP)注射液(山东新华制药股份有限公司，规格：10 mL/2mg，中国)；2,3,5-苯氯化四氮锉(2,3,5-triphenyl-2H-tetrazolium chloride，TTC)溶液(Amresco公司，美国)；Bcl-2、Bax、caspase-3兔抗鼠单抗(R&D Systems公司，美国)；Beclin单抗(Abcam生物公司，英国)；羊抗鼠IgG二抗(北京博奥森公司，中国)；苏木素、伊红染液(Sigma公司，美国)；RNA提取试剂盒、逆转录试剂盒(大连宝生物工程公司，中国)；BCA试剂盒(上海经科化学科技有限公司，中国)；尼康SMZ745光学显微镜(尼康株式会社，日本)；蛋白电泳仪1659001、CFX96 PCR仪(Bio-Rad公司，美国)；GIS-500凝胶成像仪(杭州米欧仪器有限公司，中国)。

1.2 方法

1.2.1 动物分组与给药

1.2.2 药物的配置和使用

0.5% Tween80溶解黄连素，配置成10 mg/mL的混悬溶液；于再灌注后30 min腹腔注射给药。

1.2.3 脑缺血再灌注损伤模型大鼠制备

大鼠分组后禁食12 h，10%戊巴比妥钠(3 mL/kg)腹腔麻醉，参照马贤德等[7]制备方法制备右侧大脑中动脉缺血再灌注(middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型，大鼠仰卧位固定，颈正中部位消毒、切口，暴露右侧颈总，颈内、颈外动脉，结扎颈外动脉，在残端插入0.24 mm单丝尼龙鱼线，插入栓线约18 ～ 20 mm，缝合皮肤，固定尼龙鱼线尾部于皮肤上，大鼠缺血2 h后小心抽出栓线8 mm左右，即形成MCAO模型。

1.2.4 大鼠神经功能缺损评分

参照Longa等[8]的分级法对苏醒后大鼠进行神经功能缺损评分，分别在大鼠清醒后6、24、48 h进行评分：无神经功能缺损记0分，提尾时大鼠双上肢可伸展；1分，对侧前肢不能完全伸展；2分，行走出现向对侧旋转；3分，行走出现向对侧倾倒；4分，意识丧失，不能自发行走；5分，死亡。得分为1 ～ 3分即造模成功。造模完成后，大鼠随机分组。

1.2.5 TTC染色观察大鼠脑梗死面积

治疗24 h后，每组随机选取6只大鼠取脑，冰生理盐水冲洗，切除额极、枕极，沿冠状切面切为5片，迅速置于2%TTC磷酸盐缓冲液中，37℃恒温水浴锅中避光孵育30 min，每5 min翻动一次，染色均匀后，放置于4%多聚甲醛中固定，24 h后拍照，采用Image pro软件进行分析，计算大鼠脑梗死面积百分比。计算公式：脑梗死面积=全脑梗死面积/全脑片面积 × 100%。

采用SPSS20.0统计软件对各组实验数据进行分析，计量资料数据以均数±标准差表示，计数资料数据以率（%）表示，两组比较用χ2检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。

1.2.6 HE染色观察大鼠脑组织病理学变化

治疗24 h后，每组随机选取6只大鼠，取脑组织后4%多聚甲醛固定，制备石蜡切片；常规二甲苯，乙醇低度脱水，蒸馏水冲洗；苏木精染色10 min，流水冲洗； 0.7% 盐酸乙醇5 s，流水冲洗；伊红染色复染5 min，梯度乙醇脱水2 min，二甲苯透明，中性树脂封片，显微镜下观察切片。

1.2.7 RT-PCR法检测脑组织中Bcl-2、caspase-3、Bax mRNA的表达

治疗24 h后，每组随机选取6只大鼠处死，取大鼠缺血侧脑组织，根据RNA提取试剂盒说明书提取总RNA，参照逆转录试剂盒说明书反转录为cDNA，以cDNA为模板进行RT-PCR，反应体系为20 μL： 2× SYBR Mix 10 μL，引物各0.5 μL，10× cDNA 1 μL，ddH2O 8 μL。反应参数设置为：95℃ 5 min，95℃ 10 s、60℃ 30 s，72℃ 2 min，40个循环，72℃ 10 min。引物序列见下表1。以β-actin作为内参基因，根据2-ΔΔCt法计算Bcl-2、caspase-3、Bax mRNA的相对表达量。

表1 RT-PCR引物序列Table 1 RT-PCR primer sequences

1.2.8 Western blot检测脑皮质中 Bcl-2、caspase-3、Bax、Beclin-1蛋白表达

采用Western blot检测脑组织中Bcl-2、caspase-3、Bax、Beclin-1蛋白表达量，RIPA 裂解液裂解组织，匀浆脑组织样品，提取总蛋白；BCA法测定蛋白浓度；配制10%分离胶、5%浓缩胶，等量蛋白样品(50 μg/孔)上样；浓缩胶设置电压80 V，分离胶设置电压120 V，电泳后将目的蛋白转膜至PVDF膜上，TBST清洗；5%脱脂奶封闭1 h，一抗(Bcl-2、caspase-3、Bax、Beclin-1)1∶500稀释后4℃孵育过夜，TBST清洗3次/5 min；二抗1∶5000稀释后室温孵育1 h，TBST清洗3次/5 min，滴加ECL显影液，凝胶成像系统观察蛋白表达，以β-actin为内参进行灰度值比较。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 大鼠脑缺血模型的鉴定

所有大鼠缺血前生命体征正常，处于清醒状态。模型大鼠缺血后四肢僵直，角弓反张，活动能力消失，眼球颜色由鲜红色转为灰白色；再灌注后，眼球颜色恢复，瞳孔活动，灌注约1 h后可自主活动，表明造模成功。

2.2 各组大鼠神经功能评分比较

在大鼠缺血再灌注后Sham组无行为学改变，MCAO大鼠在24 h出现不同程度的脑缺血损伤表现，再灌注6、24、48 h分别对各组大鼠进行神经功能Longa评分，Sham组无神经功能缺损，I/R组6、24、48 h 3个时间点的神经功能评分均显著高于Sham组，24 h的神经功能评分最高；与模型组比较，BBR处理组和NMDP组24 h、48 h的神经功能缺损评分显著降低(P< 0.05)，且NMDP组作用效果更显著(P< 0.05)。见表2。

表2 脑缺血再灌注大鼠神经功能评分的比较Table 2 Comparison of neurological function scores of the rats with cerebral ischemia-reperfusion

注：与Sham组比较，*P< 0.05；与I/R组比较，△P< 0.05；与BBR-L组比较，#P< 0.05。

Note. Compared with the sham group,*P< 0.05. Compared with the I/R group,△P< 0.05. Compared with the BBR-L group,#P< 0.05.

2.3 TTC染色观察黄连素对各组大鼠脑组织梗死面积的影响

Longa评分显示，24 h神经功能评分最高，对24 h的各组大鼠进行TTC染色检测脑组织梗死面积，均一红色为正常脑组织，大小不等、苍白色为梗死灶；Sham组无肉眼可见梗死组织；与Sham组比较，I/R组梗死面积百分比为(36.45 ± 4.44)显著升高(P< 0.05)，与I/R组比较，BBR-L组、BBR-M组、BBR-H组和NMDP组梗死面积分别为(20.50 ± 3.34)、(15.28 ± 0.28)、(12.34 ± 0.25)、(8.23 ± 0.19)显著减少(P< 0.05)。见图1。

2.4 HE染色观察黄连素对大鼠脑组织病理学的影响

HE染色显示Sham组大鼠神经细胞呈层状排列，形态规则，细胞核圆且核仁明显；I/R组大鼠神经细胞明显减少，排列紊乱，细胞核固缩，多数细胞坏死；BBR治疗组大鼠神经细胞也有减少，少部分细胞结构不完整，出现核固缩现象，随着BBR浓度的增加坏死细胞数量减少；NMDP组神经细胞排列较整齐，坏死细胞较BBR治疗组减少。见图2。

图1 各组大鼠梗死面积TTC染色图Figure 1 TTC staining of the infarct size of rats in each group

图2 各组大鼠脑组织的病理学改变(HE染色)Figure 2 Histopathological changes in the brain tissues of rats in each group(HE staining)

2.5 qRT-PCR检测黄连素对各组大鼠脑组织凋亡相关基因mRNA水平的影响

与Sham组比较，I/R组Bcl-2、caspase-3、Bax mRNA水平均显著升高(P<0.05)；与I/R组比较，BBR治疗组和NMDP组Bcl-2 mRNA水平均显著升高，caspase-3、Bax mRNA水平均显著降低(P< 0.05)，呈剂量依赖性；与Sham组比较，I/R组Bcl-2/Bax比值显著降低(P< 0.05)；与I/R组比较，各治疗组Bcl-2/Bax比值均显著上升(P< 0.05)，且呈剂量依赖性，BBR-H组与NMDP组无显著差异(P> 0.05)。见表3。

表3 黄连素对各组大鼠脑组织凋亡相关基因mRNA表达的影响Table 3 Effects of berberine on expression of apoptosis-related genes in brain tissues of the rats in different n=6)

注：与Sham组比较，*P< 0.05；与I/R组比较，△P< 0.05；与BBR-L组比较，#P< 0.05；与BBR-M组比较，&P< 0.05。

Note. Compared with the sham group,*P< 0.05. Compared with the I/R group,△P< 0.05. Compared with the BBR-L group,#P< 0.05. Compared with the BBR-M group,&P< 0.05.

2.6 Western blot检测黄连素对各组大鼠脑组织凋亡相关蛋白水平的影响

Western blot检测结果显示，与Sham组比较，I/R组Bcl-2、caspase-3、Bax蛋白水平均显著升高；与I/R组比较，BBR治疗组和NMDP组Bcl-2蛋白水平显著升高(P< 0.05)，BBR-H组与NMDP组无显著差异(P> 0.05)；caspase-3、Bax蛋白水平显著降低(P< 0.05)。见图3。

注：与Sham组比较，aP< 0.05；与I/R组比较，bP< 0.05；与BBR-L组比较，cP< 0.05；与BBR-M组比较，dP< 0.05。(下图同)图3 各组大鼠凋亡蛋白表达比较Note. Compared with the sham group, aP< 0.05. Compared with the I/R group, bP< 0.05. Compared with the BBR-L group, cP< 0.05. Compared with the BBR-M group, dP< 0.05.(The same in the following figure)Figure 3 Comparison of the expression of apoptotic proteins in the rats of each group

2.7 Western blot检测黄连素对各组大鼠脑组织自噬蛋白Beclin-1及Bcl-2/Beclin-1比值的影响

Western blot检测结果显示，与Sham 组比较，I/R组Beclin-1蛋白水平升高(P< 0.05)；与I/R组比较，BBR组和NMDP组Beclin-1蛋白水平显著升高(P< 0.05)。Bcl-2/Beclin-1比值显示，与Sham组比较，I/R组Bcl-2/Beclin-1蛋白水平升高(P< 0.05)；与I/R组比较，BBR组和NMDP组Bcl-2/Beclin-1比值均降低，且BBR-M组、BBR-H组、NMDP组Bcl-2/Beclin-1无显著差异(P> 0.05)。见图4。

图4 各组大鼠Beclin-1蛋白及Bcl-2/Beclin-1比值比较Figure 4 Comparison of Beclin-1 protein and Bcl-2/Beclin-1 ratio in the rats of different groups

3 讨论

缺血性脑卒中是我国居民死亡率和致残率最高的脑血管疾病，以往治疗脑缺血主要采用溶栓的方法，但易引发缺血再灌注损伤，加重病情的发展，因此探究缺血再灌注损伤的病理机制，寻找更有效的治疗方法是目前的首要任务。研究报道，脑缺血再灌注损伤涉及多种病理过程，如细胞自噬、凋亡、炎症反应等[9]。缺血再灌注损伤中Beclin、Bcl-2在细胞凋亡和自噬过程中发挥重要作用，但关于黄连素对脑缺血再灌注的保护作用是否涉及Beclin、Bcl-2的研究较少，故本研究分析黄连素对脑缺血再灌注大鼠模型基于Bcl-2/Beclin的保护作用，以期为脑缺血再灌注损伤的治疗提供一定的理论基础。

细胞凋亡是细胞程序性死亡的一种，主要是清除体内损伤细胞，维持机体存活。脑缺血再灌注后可同时激活体内凋亡与抗凋亡过程，其中caspase-3、Bax发挥促凋亡作用，Bcl-2发挥抗凋亡作用[10]。caspase-3在正常组织中以无活性的形式存在，在脑组织损伤时去磷酸化转变为有活性的caspase-3，促进神经细胞的凋亡[11]。Bcl-2可通过减少凋亡诱导因子、与促凋亡因子Bax结合、拮抗凋亡蛋白酶等发挥抑制凋亡作用。研究报道，Bcl-2可通过抑制caspase的激活阻止细胞的凋亡[12]。Bcl-2、Bax均属Bcl-2家族，研究显示Bcl-2/Bax比值对凋亡有决定作用，Bax降低、Bcl-2增强，Bcl-2/Bax比值增加，可抑制大鼠缺血再灌注心肌细胞凋亡[13]。本研究显示黄连素治疗组Bcl-2表达增加，caspase-3和Bax的表达降低，Bcl-2/Bax比值增加，提示黄连素可减少细胞的凋亡，对神经细胞具有保护作用。张童等[14]报道，黄连素预处理可减轻心肌损伤大鼠的心肌梗死面积，使心肌损伤得到明显改善。本研究中黄连素治疗后，大鼠脑梗死面积显著减少，神经细胞凋亡减少，提示黄连素对缺血再灌注脑组织具有保护作用，高浓度黄连素效果与尼莫地平效果相似。

细胞损伤过程可同时促进细胞的凋亡与自噬过程，细胞自噬的发生可延迟或者对抗细胞凋亡。Beclin-1也称为自噬相关蛋白-6(autophagy-related gene-6，ATG-6)，可以引导自噬蛋白定位于自噬小体[15]。研究表明，缺血条件下，Bcl-2、Bcl-xL等也可诱导自噬的发生，Bcl-2/Bax比值增加，促进自噬的激活[16]。抗凋亡蛋白Bcl-2在调控Beclin-1中发挥重要作用，Beclin-1存在BH3结构域，Bcl-2、Bcl-xL、Bcl-w等能够与Beclin-1蛋白的BH3结构域结合抑制Beclin-1诱导的过度自噬作用[17]。研究报道，大鼠心肌缺血时可激活自噬，再灌注阶段过度自噬会损伤心肌，适当抑制自噬可保护心肌，因此可通过调节自噬水平发挥心肌保护作用[18]。研究报道，自噬与凋亡具有密切联系，Bcl-2与Beclin-1之间的平衡对细胞的存亡具有重要作用，Bcl-2/Beclin-1复合体是评价自噬的重要指标，可通过维持适当的自噬水平，阻滞因自噬引起的细胞死亡[19]。研究报道，Bcl-2/Beclin-1复合体水平减低可对脑梗死大鼠具有神经保护作用[20]。本研究显示应用黄连素治疗后，Beclin-1表达量升高，提示黄连素可增强神经细胞自噬蛋白的表达，减少神经细胞凋亡，BBR-H组和NMDP组的Beclin-1水平处于一定范围，使得自噬作用维持一定范围，以免过度自噬引起细胞死亡，且治疗组Bcl-2/Beclin-1比值降低，提示黄连素对神经细胞具有保护作用，与上述研究结果一致。

综上所述，本研究结果提示姜黄素可激活缺血再灌注大鼠的神经细胞自噬作用，且可维持Bcl-2/Beclin-1水平，减轻过度自噬对细胞的损伤，为临床治疗提供一定的理论基础，但本研究也存在一定的不足之处，未对自噬的具体作用机制进行研究，还有待进一步深入研究。