富马酸及鱼油对瘤胃微生物体外培养中亚油酸代谢生成甲烷及CLA的影响

■闫 研 张军芳 孙 斌 王 英 崔 岩 孙建富 李香子

(延边大学农学院肉牛科学与产业技术协同创新中心，吉林省延吉市133000)

随着人类生活水平的不断提高，饮食与健康问题受到了广泛的关注。而动物脂肪酸与健康密切相关，人类如果摄食过多饱和脂肪酸容易引发各类疾病，而共轭亚油酸（CLA）是国际上公认的唯一动物源性功能性脂肪酸，是反刍动物脂肪中含有的一种具有特异性生物活性作用的微量不饱和脂肪酸，具有重要的生物学功能。Pariza等人发现牛肉含有一种由一系列共轭亚油酸异构体组成的抗致癌因子[1]。“共轭亚油酸（CLA）是唯一明确显示能抑制实验动物的致癌作用的脂肪酸”(NRC, 1996)。最近，发现了另一种有益人体健康的共轭异构体顺9，反11，顺15 亚麻酸，据报道，化学制备的天然CLnA 的异构体溶解肿瘤细胞的作用优于CLA，抑制各种人类肿瘤细胞的生长[2-5]，并且已研究表明可以显著减低总胆固醇，载脂蛋白B-100和肝脏甘油三酯[6-7]。

在全球变暖的危害中，甲烷潜在威力却远远超过了二氧化碳。甲烷是在反刍动物瘤胃微生物分解、发酵植物纤维过程中产生的。而丙酸是一种生成甲烷的重要物质，并且在瘤胃中由丙酸前体物合成。故调控瘤胃发酵以减低甲烷的产生和增加CLA或CLnA的产量将有利于畜牧业发展、环境和人类的健康。理论上来讲，通过选择性的电子代谢途径降低电子能够降低甲烷生成[8]。在瘤胃中使用丙酸盐生成前体转变瘤胃发酵的丙酸盐生成途径将是理想的方法[9], 因为它的前体利用代谢氢生成丙酸，并且在瘤胃发酵过程中改变代谢氢利用效率而引起其他中间代谢产物和终产物的分配[10]。而富马酸已被确认可以改变氢传递的路径，通过减少甲烷排放量增加丙酸的含量[11-12]。也有报道鱼油也能增加瘤胃丙酸（C3）的含量[13-14]，并被作为一种有效的瘤胃甲烷抑制剂[15]。对植物油，丙酸前体物（fumarate, FA）及鱼油对共轭亚油酸和甲烷生产在瘤胃微生物发酵中的关联效应的研究，至今尚未见报道。

因此，本试验旨在研究富马酸及PMUF（C20:5，C22:6）在瘤胃微生物的作用下对亚油酸的代谢机制及其调控脂肪酸代谢过程中对甲烷合成效率的影响。

1 材料与方法

1.1 瘤胃液采集

3 头体重为650 kg 左右，安装有瘤胃瘘管的荷斯坦母牛，采食以稻草（40%）、玉米、豆粕等为精饲料（60%），苜蓿草为粗饲料，每天早晚饲喂2 次（5 kg/d，6：00 和18：00），自由饮水，瘤胃液于晨饲2 h（8：00）后进行采集。将从3 头牛瘤胃中等量采集的样本在混合器内混合20 s，分离饲料颗粒中的细菌，用12 层纱布过滤，通入二氧化碳（CO2）30 s，期置于39 ℃水浴锅，充入N2。

1.2 人工唾液的组成

人工唾液制备后，进行全自动高压灭菌，最后调整pH值至6.5。人工唾液成分见表1。

表1 人工唾液成分

1.3 试验处理与培养方法

45 ml瘤胃液滤液与45 ml McDougall's 人工唾液1:1 混合于150 ml 培养瓶中培养。试验分五组：一组为对照组（CON 组）不添加任何物质；其他四组为试验组，分别是(SO 组)120 mg 红花油、（SO-FO 组)120 mg 红花油+24 mg 鱼油,；（SO-FA 组）120 mg 红花油+24 mmol/l 富马酸；（SO-FO-FA 组）24 mg 鱼油+24 mmol/l富马酸。将1.2 g饲料(精:粗=7:3)作为营养底物加入到各处理中，用安装3相阀丁基橡胶塞封住培养瓶，在39 ℃下自动控温震荡培养箱内以135 r/min速率厌氧培养12 h。在同样条件下，每个处理设置3 个平行样，试验设置3个重复。

饲料中的化学成分列于表2 中，瘤胃中脂肪酸、饲料和油脂中的添加量列于表3中。

表2 培养液中饲料成分（%，以DM为基础）

表3 添加到培养液中瘤胃液、混合饲料和油中的C18脂肪酸的浓度(%)

1.4 分析方法

pH值：用pH测定仪测定。

铵态氮的测定：参照Fawcett和Scott(1960)方法用紫外/可见光分光光度计（DU-650）进行测定[16]。

挥发性脂肪酸VFA（乙酸、丙酸、丁酸）浓度的测定：利用气相色谱法，用已知浓度的VFA 标准品来制作出标准曲线，再利用内标（三甲基乙酸）定量分析。

甲烷（CH4）的测定与计算：利用气相色谱法，以甲烷标准气来制作标准曲线再进行分析。计算方法CH4产量参照Lopez和Newbold(2007)方法。

培养液脂肪分离与甲酯化方法：

培养液的脂肪提取液参照Folch's 溶液进行配制，氯仿:甲醇=2:1混合均匀后，取30 ml倒入混合培养液中低温震荡24 h，加入C13:0 作为脂肪酸分析内标；在2 000 r/min离心20 min，取下层液体，利用氮吹仪使有机溶剂等挥发，从而萃取脂肪。脂肪酸甲酯化按Lepage和Roy (1986)方法进行[17]。

气相色谱检测条件：脂肪酸甲酯（FAME）的检测利用气相色谱（安捷伦6890N，自动进样系统）定量检测，内标C13:0。脂肪酸计算根据内标法进行定量计算。已知浓度富马酸和乳酸作为定性与定量分析标准品。

瘤胃微生物RNA 提取与分析：为测定培养液中甲烷生成菌mRNA的表达量，在3 h和6 h的时候取培养液1 ml 于2 ml 小离心管，并立放置在冰块上以防止微生物的活动，然后分别低速离心（800 r/min，4 ℃，10 min）去除饲料颗粒。收集上清液并再次高速离心30 min 分离出细菌（2 000 r/min，4 ℃）。分离出的细菌沉淀，然后根据多物种RNA 及原核生物RNA 试剂盒说明书中提取方法进行提取与分离，合成cDNA,使用特异性引物来进行荧光定量PCR 分析。基因表达的相对定量分析采用2-△△ct方法分析[18]。

1.5 统计分析

数据采用最小二乘方差分析，根据SAS 的线性模型分析，不同处理组之间的显著性分析按照以下S-N-K`s Test 线性模型分析[19]。

2 结果

2.1 发酵参数和甲烷的产生

如图1 所示，各处理pH 与培养时间负相关。在3h 时,与其他组相比，SO-FA 和SO-FO-FA 处理组中pH 显著增加(P＜0.05)。红花油和鱼油对培养液的pH值影响无显著差异（P＞0.05）。从图2 结果显示，所有处理组中的NH3-N随培养时间的延长而增加。在3 h时,与对照组相比，试验组甲烷菌的mRNA 表达无显著差异（P＞0.05）（图3），在6 h时低于对照组，SO-FO,SO-FA，SO-FA-FO处理组的mRNA表达要比SO处理组的低（图4）。从表4 可以看出，与其他组相比，SOFA 和SO-FO-FA 两组丙酸增加显著，丁酸降低最显著(P＜0.05)，在12 h 时，与对照组相比，SO-FO, SOFA，SO-FA-FO 处理组丙酸比例下降，其中SO-FA，SO-FA-FO 处理组C2/C3 值降低显著（P＜0.05）（表4）。与对照组相比，所有处理组总VFA量也与培养时间正相关。3 h 时，SO-FA 和SO-FO-FA 两个处理组总VFA 产气量比其他两处理组产气量多(P＜0.05)（见表4），并且试验组中气甲烷体总量少，且试验组甲烷的降低量差异显著(P＜0.05），其中SO-FA-FO 组最少(见表5)，SO 组甲烷量高于SO-FO 和SO-FA，SO-FO和SO-FA 高于SO-FO-FA 组。在12 h 后，SO-FA 和SO-FA-FO 的气体总量高于SO 组和SO-FO 组(表5)。从表6 中可以看出硬脂酸，反式11，油酸和反式9，油酸的浓度与培养时间正相关，而亚油酸和总共轭亚油酸（CLA），顺9，反11-共轭亚油酸和反10，顺12-共轭亚油酸与培养时间负相关。与SO 组比较，SO-FO、SO-FA、SO-FA-FO 处理组中硬脂酸和顺式11，油酸浓度下降，同时总共轭亚油酸（CLA），顺9，反11-共轭亚油酸和反10，顺12-共轭亚油酸浓度上升显著（P＜0.05），其中SO-FA-FO的总共轭亚油酸（CLA）浓度最高，SO-FA-FO 中的顺9，反11-共轭亚油酸的浓度高于其他三组（P＜0.05）。

图1 以红花油为底物在不同时间内添加鱼油和富马酸对培养液pH值的影响

图2 以红花油为底物在不同时间内添加鱼油和富马酸对培养液NH3-N浓度(mg/100 ml)影响

图3 以红花油为底物添加富马酸和鱼油在3 h时对甲烷菌mRNA表达的影响

图4 以红花油为底物添加富马酸和鱼油在6 h时对甲烷菌mRNA表达的影响

表4 以红花油为底物添加富马酸和鱼油对培养液中主要VFA浓度和成分的影响

表5 以红花油为底物在培养12 h内添加富马酸和鱼油对总产气量和甲烷的影响

2.2 培养液中的富马酸和乳酸浓度的测定

从图5 表中可以看出，与其他组相比，在SO-FA和SO-FO-FA 中富马酸的浓度明显快速下降（P＜0.05），在3 h后保持平稳。并且在3 h时，与其它处理组相比，SO-FA和SO-FO-FA组中的富马酸显著的降低了乳酸的含量（P＜0.05）(图6)。

3 讨论

在本试验中，在各处理组中补充混合饲料（1.2 g，DM），避免因营养物质短缺而影响瘤胃微生物的正常发酵。从奶牛瘤胃中提取瘤胃液的所有程序确保准确，尽量减少实验误差。因此，才能够正确反映瘤胃微生物的发酵参数，由图中培养液中随着时间的增加pH 的降低，氨氮、总挥发性脂肪酸的增加来看，体外发酵是正常的。

从图1 SO-FA 和SO-FO-FA 中pH 值的增加，可以推断出富马酸对瘤胃发酵有积极作用，这与Martin、Streeter(1995)和Li 等(2009)的观测一致[20-21]。pH值的增加，可能是富马酸通过瘤胃微生物增加了乳酸的利用率(Nisbet 等，1991，1993)[22-23]，从而降低了乳酸的浓度。SO-FA 和SO-FO-FA 处理组中乳酸的浓度比其它处理组要低，这也与Nisbet 和Martin(1990)研究表明：四倍剂量的富马酸能够刺激瘤胃微生物吸收乳酸从而来抑制pH的降低[24]保持一致。

SO-FA 和SO-FO-FA 处理组中总VFA 的浓度增加不显著，这与Martin(1995)和Li等(2009)研究的添加富马酸能够增加VFA 的浓度的结果相似。富马酸是二元酸丙酸途径的关键前体之一，同时也参与丙酸的代谢途径。在本试验中，从表4 可以看出SO-FA 与SO-FO-FA 处理组中C3 比例明显增加，在培养液发酵3 h后，C3比例的增加与富马酸浓度的降低密切相关，这表明补充富马酸有助于瘤胃微生物丙酸的代谢。这与Callaway 等（1996）在体外培养中所得到的结果相似[25]。C3 比例的增加是由于富马酸的添加影响了H2的代谢途径，并与甲烷菌竞争利用H2。从表4可以看出，添加油能够增加C3的比例，而添加鱼油的效果比添加红花油的效果好。Keady 和Mayne 等(2000)研究发现，添加鱼油能够增加瘤胃丙酸的浓度，Van Nevel 等(1974)的研究表明，添加鱼油能够减少甲烷的产生[26]。Demeyer 等报道也证明了甲烷产生的减少往往伴随着丙酸产量的增加[27]。

表6 以红花油为底物添加富马酸和鱼油对培养液中主要C18脂肪酸浓度影响（mg）

从表5 中可以看出，单个添加、或者联合添加都极大的抑制了甲烷的产生，SO，SO-FO，SO-FA和SOFO-FA 处理组与空白对照组中甲烷量相比分别降低了19.68%、42.58%、39.27%和51.90%。甲烷产生的降低与添加的油和富马酸有关系。当在日粮中添加脂质，会使瘤胃发酵速度减慢，从而使甲烷的生成量减少，这是很常见的。Fievez 等研究表明鱼油能够被作为一种有效地甲烷抑制剂。Czerkawski 等也指出，不饱和脂肪酸可以利用氢进行氢化，从而可以与甲烷的产生形成竞争来抑制甲烷的生成[28]。在本实验中，红花油含有大量的亚油酸(C18:2)(占总脂肪酸的61.98%，见表2)。先前也有研究表明，无论在体内还是体外培养实验中富马酸都表现出了很强的竞争性，与甲烷菌竞争利用氢[29-31]。在本实验中富马酸用来减少甲烷产生效果比较好。从图3 和图4 中甲烷菌mRNA 的表达可以得出：添加鱼油和富马酸能够降低甲烷的产生。从图5 可以看出，富马酸在瘤胃微生物中代谢速率很快。在发酵1 h 时SO-FA 和SO-FO-FA 中富马酸的回收率达到84.63%和86.25%，但是12 h 时几乎所有的富马酸被微生物所发酵（99.38%到99.29%）。

图5 以红花油为底物添加富马酸和鱼油对培养液中富马酸浓度（mM）的影响

图6 以红花油为底物添加富马酸和鱼油对培养液中乳酸浓度（mM）的影响

在培养1 h 时所有处理中硬脂酸（C18:0）和共轭亚油酸（CLA）及同分异构体(顺9，反式11-共轭亚油酸和反10，顺式12-共轭亚油酸)浓度成上升趋势，然而，随着时间的延长，生物氢化逐渐稳步（见表6）。最高浓度可能表明异构化迅速的发生，此后，生物氢化加速了异构化进程，从而CLA得浓度大大降低了(表6)。油的添加增加了CLA 产生，可能是由于红花油中含有大量的顺9，反11-亚油酸。SO-FO 中顺9，反11-共轭亚油酸的浓度比SO 中高，是由于油改变了不饱和脂肪酸氢化的途径。Wang等人在体外培养实验中发现鱼油和红花油能够增加CLA的产生[32]。SO-FA-FO 中c 顺9，反11-共轭亚油酸比SO-FO 和SO-FA 中的高，这表明：鱼油和富马酸单独影响C18:2（亚油酸）氢化过程的能力比两者联合的效果差。

4 结论

在本试验的条件下研究表明，富马酸和PMUF不影响瘤胃微生物的发酵作用，PMUF 含有多个不饱和双键，而双键的氧化饱和作用又能够影响亚油酸的生物氢化作用，可以进一步提高CLA 的生成效率，降低甲烷的产量以及甲烷生成菌的mRNA 表达量。富马酸和鱼油能够改变电子的传递途径，也能够与甲烷菌竞争性利用氢，同时也能够影响不饱和脂肪酸氢化的代谢途径，在培养中CLA 的增加同时也伴随着甲烷产生的减少。故而，二者协同作用，可以大幅度提高共轭亚油酸（CLA）生成量，大幅度降低甲烷的产量。