沙葱及其提取物对肉羊瘤胃微生物区系和瘤胃液消化酶活性的影响

■赵亚星 敖长金 包志碧 范泽军 杜红喜

（内蒙古农业大学动物科学学院，内蒙古呼和浩特010018）

反刍动物主要通过瘤胃微生物和自身分泌的酶对饲料进行消化。瘤胃微生物可消化饲料中50%的粗纤维和70%～85%的可消化干物质，产生挥发性脂肪酸、CO2、乳酸及甲烷，并产生微生物蛋白和B 族维生素供反刍动物机体利用[1]。因此，通过促进或抑制某些瘤胃微生物，可使得消化代谢的损失降到最低，提高其饲料利用率和生产性能。植物提取物作为瘤胃调控剂具有天然无危害的特点，因此成为当下研究的热点。李大彪等[2]研究指出在山羊和绵羊饲粮中添加单宁能够降低瘤胃总细菌和总厌氧真菌的含量，且山羊瘤胃内总细菌和总厌氧真菌含量下降程度显著高于绵羊。王梦竹等[3]研究发现不同剂量的苜蓿黄酮对纤维素酶活性影响不同,当添加4%时,木聚糖酶、纤维二糖酶等纤维素酶活性最高。苑文珠[4]的研究结果表明在饲粮中添加茶皂素可显著降低原虫，并改善湖羊的生产性能。

沙葱，又名蒙古韭，属被子植物门，百合科，葱属。是一种含有较高粗蛋白和代谢能，较低中性洗涤纤维的优质牧草，为牛羊等反刍动物喜食，主要分布在内蒙古中西部地区[5]。沙葱的叶和花具有药理作用，既能开胃、消食、降血压，又能提高免疫力，抗菌抗病毒[6]。沙葱能够改善羊肉风味[7]，改善肉品质[8]，提高动物抗氧化能力及免疫力[9]。

目前沙葱作为植物添加剂的研究热点之一，其研究主要集中于沙葱及其提取物对肉羊生产性能和肉品质的影响等方面，关于沙葱水溶性提取物和脂溶性提取物对瘤胃微生物以及瘤胃消化酶活性研究较少。因此，本试验通过在肉羊饲粮中添加沙葱及其提取物，研究其对肉羊瘤胃微生物和消化酶活性的影响，以期在瘤胃微生物层面上揭示沙葱及其提取物改变羊肉品质的作用机理，并为沙葱及其提取物在肉羊实际生产中提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验动物与饲粮

1.1.1 试验动物

选取24只，体况良好，体重（37.1±0.5）kg相近的杜寒杂交F1 代（小尾寒羊×杜泊羊）进行试验。试验期内每天6：00和18：00饲喂2次，自由饮水。基础饲粮组成和营养成分见表1。

1.1.2 沙葱提取物的制备

沙葱提取物的制备：将沙葱粉脱脂后与75%的乙醇按照料液比为1:30 混合，超声微波处理20 min，得到黄色粉末的脂溶性提取物。脂溶性提取物的得率为2.8 g/10 g 沙葱粉。将沙葱粉脱脂后与蒸馏水按照料液比为1:20 混合，放于65 ℃烘箱，得到红褐色粉末的水溶性提取物。水溶性提取物的得率为3.4 g/10 g沙葱粉。

本次试验开始前已知沙葱水溶性提取物中主要活性物质为有机酸及其衍生物（α-羟基异丁酸、2-羟基丁酸）、植物激素（N6-异戊烯腺嘌呤）、羟基肉桂酰衍生物（对羟基苯丙酸）。沙葱脂溶性提取物中主要是氨基酸衍生物[S-（5-腺苷）-L-高半胱氨酸]，脂质-甘油磷脂（溶血磷脂酰胆碱)、脂质-甘油脂(单酰甘油脂)[10]。

1.1.3 基础饲粮

1.2 试验设计

本试验采用单因素随机分组设计，每组羊按照同质性原则随机分为4组，每组6只羊。试验期共75 d，其中预试期15 d，正式试验期60 d。对照组（CON Group）饲喂基础饲粮，沙葱组（AMR Group）在基础饲粮中添加10 g/(d·只)沙葱粉，水溶组（AWE Group）在基础饲粮中添加3.4 g/(d·只)沙葱水溶性提取物，脂溶组（AFE Group）在基础饲粮中添加2.8 g/(d·只)沙葱脂溶性提取物。

表1 基础饲粮组成及营养水平（干物质基础）

1.3 测定指标

1.3.1 瘤胃液的采集与测定

在正饲期内，每隔30 d各组随机选取4只羊在晨饲后2 h 采集瘤胃液。装保温瓶后带回实验室，经四层无菌无酶纱布过滤后，放入液氮罐种待测。

1.3.2 瘤胃微生物的定量

1.3.2.1 总DNA的提取

采用珠磨砚法提取瘤胃微生物总DNA，本方法须注意的是玻璃珠的用量和细胞的破碎程度以及蛋白质的去除[11]。

1.3.2.2 瘤胃微生物引物的设计与合成

1.3.2.3 目的片段的扩增

25 μl 的反应体系：模板2 μl，上游引物1 μl，下游引物1 μl，DNA连接酶12.5 μl，dd水8.5 μl。

反应参数：94 ℃预变性5 min，95 ℃变性30 s，退火40 s，72 ℃延伸1 min,36个循环。扩增产物经1.5%琼脂糖电泳检测后，用胶回收试剂盒（Axygen Biosciences）将目的片段进行回收。

1.3.2.4 PCR产物的克隆

根据pGM-T 克隆试剂盒说明，将PCR 产物与pGM-T载体进行连接。

10 μl 的反应体系：目的PCR 片段7 μl，T4DNA ligase 1 μl，10×T4DNA Ligation Buffer 1 μl，pGM-T Vector 1 μl。使用Top10感受态细胞。

1.3.2.5 阳性质粒的筛选与鉴定

将过夜的菌液做PCR 检验，配置25 μl 的体系：模板（菌液）2 μl，上游引物1 μl，下游引物1 μl，Mix 12.5 μl。

表2 瘤胃微生物的引物序列及参数

PCR反应的产物经过电泳后，所得的条带与目的条带大小一致，故为阳性克隆菌液，委托华大基因科技服务有限公司进行测序。验证正确的菌液后，根据质粒小提试剂盒的说明书提取质粒。

1.3.2.6 标准曲线的制作

提取质粒后用酶标仪测定质粒的浓度，根据公式计算出阳性质粒的拷贝数（计算公式：质粒拷贝数（个/μl）=[6.02×1023（个/mol）×DNA 浓度（ng/μl）]/{DNA长度（bp）×660[g/(mol·bp)]}[13]。

将已知拷贝数的质粒以10倍浓度梯度连续稀释5 个梯度，每梯度设3 个重复，无酶水作对照，进行实时荧光定量PCR，最终得到与质粒拷贝数和循环阈值（Ct）对应的线性关系的标准曲线。

1.3.2.7 瘤胃微生物实时定量PCR检测

参照荧光染料SYBR PreMix Plus 说明书建立25 μl的体系，将样品统一稀释到10 ng/μl。将实时荧光定量PCR得到的Ct值代入标准曲线，得到总细菌，总厌氧真菌和原虫的数量。计算公式如下：

总细菌、总厌氧真菌和原虫数量（个/g）=（MQ×C×VD）/（S×V）[14]

式中：MQ——根据标准曲线Ct计算得到的总细菌，总厌氧真菌和原虫数量（个）；

C——每个样品基因组DNA浓度（ng/μl）；

VD——提取DNA 时最后溶解DNA 的ddH2O 的体积（μl）；

S——用于实时定量PCR的DNA的量（ng）；

V——提取粗DNA时瘤胃内容物样品用量（g）。

总细菌，总厌氧真菌和原虫数量最终用拷贝数的常用对数[1g（个/ml）]表示。

1.3.3 纤维素酶活性的测定

按照Agarwal 等[15]的方法对瘤胃液滤纸酶、羧甲基纤维素酶、木聚糖酶、纤维二糖酶、淀粉酶和蛋白酶的活力进行测定。滤纸酶活力指1 g酶水解反应中每分钟生成1 μmol 葡萄糖的酶量。羧甲基纤维素酶活力指一定条件下每分钟从1 g 羧甲基纤维素钠中降解1 μmol 还原糖所需的酶量。木聚糖酶活力指一定条件下每分钟催化分解1g 木聚糖产生1 μmol 木糖所需的酶量。纤维二糖酶活力定义为1 g酶水解反应中每分钟生成1μmol还原糖所需的酶量。淀粉酶活力指每分钟水解1ml淀粉生成1μmol还原糖所需的酶量。蛋白酶活力指1 ml 液体酶一定条件下每分钟水解酪素产生1 μg酪氨酸所需的酶量。

1.4 数据统计分析

利用Excel 整理数据，SPSS 17.0 软件的one-way ANOVE 对数据进行单因素方差分析，用Duncan's 法对平均值进行多重比较。P＜0.05 为差异显著判定标准，P＞0.05为差异不显著判定标准。

2 结果

2.1 瘤胃微生物标准质粒PCR检测

对目标片段进行胶回收进行克隆，将挑取得单克隆菌液落于液体培养基中过夜。提取质粒，PCR检测是否为目的片段，然后送检测。

2.2 阳性克隆验证

测序结果表明阳性克隆片段与总细菌的同源性为98%。与厌氧真菌的同源性为99%，与原虫的同源性为97%，且含有完整的引物序列，这说明构建了含有目的片段的质粒，能够制作标准品。

2.3 标准曲线

总细菌数量（y1）、总厌氧真菌数量（y2）、原虫数量（y3）、牛链球菌（y4）、栖普雷沃氏菌（y5）根据Ct(x)的标准曲线公式如下：

y1=-3.10Lg(x)+43.10；R2=0.998；y2=-3.23Lg(x)+43.45，R2=0.960；y3=-3.34Lg(x)+43.36；R2=0.989；y4=-3.792Lg(x)+66.79，R2=0.924；y5=-3.816Lg(x)+57.63，R2=0.937。

2.4 沙葱及其提取物对瘤胃微生物区系的影响

由表3可知，与对照组相比，在30 d和60 d时，试验组的细菌含量显著提高（P＜0.05）。在60 d时，水溶组的总厌氧真菌含量显著高于（P＜0.05）其他组。在60 d时，沙葱组的原虫含量显著（P＜0.05）降低。各处理组的牛链球菌和栖普雷沃氏菌含量没有显著变化（P＞0.05）。

2.5 沙葱及其提取物对肉羊瘤胃液消化酶活性的影响

由表4可知，与对照组相比，在30 d和60 d时，沙葱及其提取物组木聚糖酶活性和脂肪酶活性显著（P＜0.05）提高，在60 d时，沙葱及其提取物组滤纸纤维素酶活性显著（P＜0.05）提高。在60 d 时，沙葱水溶组β-葡萄糖苷酶活性显著（P＜0.05）提高。在30 d时，沙葱及其提取物组淀粉酶活性显著提高。60 d时，脂提组、水提组淀粉酶活性显著（P＜0.05）提高。

3 讨论

3.1 沙葱及其提取物对瘤胃微生物区系的影响

在反刍动物的瘤胃中栖息着数目庞大、种类复杂的各种微生物，主要包括细菌、原虫和厌氧真菌。反刍动物主要依赖瘤胃内的微生物能够有效的消化和利用饲料中的各种营养物质。细菌是瘤胃内数量最多，功能最复杂的一类微生物，也是瘤胃内最主要的消化营养物质的微生物[16]。瘤胃内的白色瘤胃球菌、黄色瘤胃球菌和产琥珀酸丝状杆菌是主要的纤维分解菌，可产生大量的纤维素酶和半纤维素酶，在纤维降解过程中发挥重要的作用[17]。本试验研究发现在肉羊饲粮中添加沙葱及其提取物后显著提高了肉羊瘤胃内总细菌含量，可能原因是添加沙葱及其提取物抑制了原虫的数量从而影响其对细菌的吞噬能力，因此，瘤胃内细菌大量增殖，利于改善纤维物质在瘤胃内的发酵和降解而提高其消化利用率。

表3 沙葱及其提取物对肉羊瘤胃微生物区系的影响[lg(个/ml)]

表4 沙葱及其提取物对肉羊瘤胃液消化酶活性的影响

瘤胃中各类微生物之间的协同作用下反刍动物得以分解利用饲料中的纤维物质，其中细菌和真菌在降解纤维物质过程中发挥了80%的作用[18]。反刍动物瘤胃内厌氧真菌的数量及种类均少于细菌，但其可对粗饲料的纤维组织结构进行破坏，打开细菌进入纤维的通道，因此在瘤胃内纤维消化过程中占据主导地位[19]。据Joblin 报道，瘤胃液真菌产生的纤维素酶的活性高于瘤胃纤维素分解菌产生的酶[20]。厌氧真菌可释放降解纤维的关键酶，并产生酯酶及木质素酶，因此对维护瘤胃功能方面起着重要作用[21]。张霞[22]研究发现在绵羊饲粮中添加沙葱水溶性提取物后显著提高了真菌的数量，与本试验结果一致，可能原因是沙葱水溶性提取物提高了真菌生长所需要的氮源铵根离子和氨基酸浓度，从而使真菌数量增加。

原虫是瘤胃内微生物的重要组成部分，主要通过物理作用破坏纤维结构，同时可分泌纤维素降解酶[23]。Coleman等[24]研究表明内毛虫等个体较大的原虫能够吞噬和消化纤维素，并利用纤维素的降解产物合成其细胞内的多糖。瘤胃微生物种类和数量主要受动物品种、日粮结构、环境、日粮添加物等因素的影响。赵春艳[25]研究指出，在绵羊饲粮中添加沙葱能够有效抑制原虫数量，从而使细菌合成MCP 的量增加。赵国芬[26]通过在绵羊饲粮中添加4%沙葱发现纤毛虫的数量显著减少。本试验研究发现在肉羊饲粮中添加沙葱可显著降低瘤胃原虫数量，与上述研究结果一致，可能原因是添加沙葱破坏了原虫的生活环境或者直接作用于原虫，从而导致原虫数量降低。

3.2 沙葱及其提取物对瘤胃内纤维素酶活性的影响

反刍动物瘤胃内纤维类物质主要依靠瘤胃内微生物分泌的各种酶进行分解和消化，进而被宿主动物所利用，因此反刍动物瘤胃微生物对饲料的利用效率较大程度上取决于瘤胃微生物酶的活性。瘤胃微生物产生的纤维素酶包括内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶及β-葡萄糖苷酶，在这3 种酶的协同作用下才能降解纤维的结晶结构，上述酶的活性可以更准确的反映出瘤胃内微生物对纤维物质的利用和合成MCP的能力[27]。

羧甲基纤维素酶是一种内切葡聚糖酶，可将纤维素分解为葡萄糖和纤维二糖，所有纤维素分解菌均能产生此酶。张霞[22]研究发现，在绵羊饲粮中添加沙葱和沙葱提取物显著提高了羧甲基纤维素酶的活性，本试验也得出类似的结果，在肉羊饲粮中添加沙葱及其提取物能显著提高肉羊瘤胃内羧甲基纤维素酶活性，这表明添加沙葱及其提取物可加快饲料纤维物质的降解速度，提高纤维的初始消化率。木聚糖酶主要由瘤胃内黄色瘤胃球菌和白色瘤胃球菌产生，是一组能够水解木聚糖的多酶复合体，包括内切β-1，4木聚糖酶、外切β-1，4木聚糖酶和β-木糖苷酶。β-葡萄糖苷酶又称为二糖水解酶，可水解纤维二糖，芳基-β-葡萄糖苷酸而产生葡萄糖等终产物。滤纸纤维素酶活性是内外切葡聚糖酶和葡萄糖甘酶协同作用的结果，是瘤胃总纤维素酶活的衡量指标。微晶纤维素酶是表明纤维酶解效率的重要指标，其活性可反映瘤胃内多种酶活性。果胶酶可将植物中果胶分解为β-半乳糖醛酸，其本质是聚半乳糖醛酸水解酶。本试验研究结果显示，在肉羊日粮中添加沙葱及其提取物能显著提高木聚糖酶活性，这与前人研究结果一致[22],可能原因是饲粮中添加沙葱及其提取物提高了瘤胃内TVFA的浓度，TVFA释放的能量充足，微生物分解饲粮产生的NH3-N 与能量的供应水平最适宜微生物的生长繁殖，MCP 浓度的增加又进一步改善瘤胃发酵，所以纤维分解菌分泌的酶活性提高。

3.3 沙葱及其提取物对瘤胃内淀粉酶、脂肪酶和蛋白酶活性的影响

提高消化酶活性可加快营养物质的降解速率，为反刍动物提供更多的可吸收和利用的营养物质，进而提高反刍动物的营养物质消化率、饲料利用率和生产性能。瘤胃微生物分泌的淀粉酶可将瘤胃内大部分淀粉水解为麦芽糖，降解所得的麦芽糖转化为VFA为机体提供能量[28]，其活性的高低直接决定着饲料中可溶性碳水化合物的分解程度[29]。瘤胃内牛链球菌、丁酸梭菌及嗜淀粉瘤胃杆菌是主要的淀粉分解菌，能够分泌较强活性的淀粉酶[30]。有研究表明瘤胃内大部分内毛虫和瘤胃厌氧真菌也具有分解淀粉的能力[31]。本试验研究发现，添加沙葱及其提取物可显著提高肉羊瘤胃内淀粉酶活性，可能是由于沙葱及其提取物通过促进瘤胃纤维分解菌的生长[10]，提高了粗饲料的消化率，进而使各种碳水化合物显著增加，提高了淀粉酶的活性。

瘤胃液中含有少量的脂肪酶，能够参与饲料中脂类物质的消化和代谢，外源脂肪需经过脂肪酶的消化分解后才能透过细胞膜，体内脂肪的储存、动用和细胞内的脂类代谢都需要脂肪酶的参与。脂肪酶先将脂肪水解为甘油和脂肪酸，水解产物再进入小肠黏膜细胞被进一步消化利用[32]。本试验研究发现在肉羊饲粮中添加沙葱及其提取物显著提高了瘤胃液脂肪酶活性，这与赵春艳[25]和赵国芬[26]的研究结果一致。

瘤胃内降解蛋白质的微生物较多，但真菌和原虫对蛋白质的降解能力较弱，溶纤维丁酸弧菌、栖普雷沃氏菌和嗜淀粉拟杆菌的数量多且活性强，对瘤胃内蛋白质降解具有重要作用[33]。姜卫红[34]通过一系列的研究指出蛋白酶在瘤胃内pH 值为7.0 时活性最高。本试验研究发现在肉羊饲粮中添加沙葱及其提取物，瘤胃内蛋白酶活性没有显著变化，原因可能是蛋白酶的活性较稳定，不易变化[30，33，35]。

4 结论

①饲粮中添加沙葱及其提取物能够促进肉羊瘤胃总细菌和总厌氧真菌的生长，同时降低瘤胃原虫的数量。

②饲粮中添加沙葱及其提取物能够促进瘤胃内纤维素酶、淀粉酶、脂肪酶的分泌和活性的提高。

③沙葱及其提取物能够影响瘤胃微生物区系，且提高瘤胃液相关消化酶的活性。