羟基红花黄色素A通过 Wnt/β-catenin信号通路抑制卵巢癌生长

龚建明 周莹巧 林 琪

卵巢癌是女性生殖器官常见的肿瘤之一，病死率位居第1位，对女性生命造成严重威胁。尽管目前手术及化疗技术有一定的改进，但复发率和耐药性仍较高。故迫切需要寻找一种有效的抗卵巢癌的药物。Meselhy等[1]从红花中分离得到羟基红花黄色素A(hydroxysafflor yellow A, HSYA)，该成分是红花活血化瘀的主要有效成分。历代医书均有详细记载，已有报道其对多种瘀血凝结阻滞型恶性肿瘤均有疗效，但其抗癌机制有待进一步研究[2,3]。本研究探讨HSYA对体内外卵巢癌生长的影响及其机制，为HSYA治疗卵巢癌提供有益的实验基础。

材料与方法

1.药品试剂：CCK-8试剂盒、AnnexinV-FITC细胞凋亡检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所；胎牛血清、RPMI1640培养基购自美国Gibco公司；Nuclear β-catenin、menin、MMP7、Survivin抗体购自美国Sigma公司；细胞核蛋白提取试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司；人卵巢癌细胞株HO-8910PM购自中科院上海细胞库；HSYA标准品购自中国药品生物制品检定所，取HSYA用0.9%氯化钠溶液配置成所需的浓度，微孔滤膜过滤除菌，-20℃保存代用。雌性BALB/c裸鼠，8～10周龄，体质量18～20g，购自中科院上海实验动物中心。

2.细胞培养及分组：细胞株HO-8910PM培养在含10%胎牛血清RPMI1640培养液中，培养条件为37℃、5% CO2的培养箱下培养。细胞实验分为两组，即对照组(以0.9%灭菌氯化钠溶液处理细胞株HO-8910PM)和HSYA组(以200μmol/L HSYA作用HO-8910PM 24h)。

3.CCK-8法检测细胞增殖：收集处于对数生长期的HO-8910PM细胞，制成单细胞悬液，接种到96孔板，各孔细胞均匀，过夜贴壁后，分别加入不同浓度HSYA(50、100、200和400μmol/L)，每组3孔，置于37℃培养箱作用24h，同时设置空白调零组，以及阴性对照组。药物作用结束前1h，各孔加入CCK-8溶液0.01ml，继续培养1h，酶标仪测A450值，实验重复3次。细胞存活率=(实验组A450值-空白调零组A450值)/(对照组A450值-空白调零组A450值)×100%。

4.流式细胞术检测细胞凋亡：将对数生长期HO-8910PM细胞(1×106个/ml)接种在6孔培养板中，HSYA组每孔加入200μmol/L HSYA作用24h，细胞经0.25%胰蛋白酶消化，1000r/min离心5min，按试剂盒说明1∶1∶50比例将AnnexinV-FITC、PI、HEPES缓冲液配成染液，每100μl染液重悬1×106个细胞，室温避光培养15min上机检测，激发波长488nm，发射波长530nm。

5.Western blot法检测卵巢癌HO-8910PM细胞Nuclear β-catenin、menin、MMP7、Survivin蛋白的表达：收集各组细胞，加入含有PMSF的细胞裂解液，提取上清液为细胞总蛋白。按试剂盒说明书提取细胞核蛋白。测量蛋白浓度后取等量蛋白质样品上样，于12%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳2h，转膜，用10%脱脂奶粉封闭后加入β-catenin抗体、menin抗体、MMP7抗体、Survivin抗体为第一抗体，4℃过夜，再度洗膜后加入辣根过氧化物酶标记的二抗中，室温孵育2h，ECL显色，X线胶片曝光。

6.裸鼠卵巢癌皮下移植瘤的建立：选择8～10周龄雌性BALB/c裸鼠，将2×106个HO-8910PM细胞悬浮于0.2ml培养基中，注射到裸鼠背部靠近右侧后肢皮下建立裸鼠卵巢癌皮下移植瘤模型，接种2周后，挑选出移植瘤体积直径约10mm的裸鼠。再将这些裸鼠随机分为对照组和HSYA组，每组8只，对照组灌胃予0.9%氯化钠溶液0.2ml/只；HSYA组灌胃予HSYA 50mg/kg，每2天给药1次，共2周。第8周处死裸鼠留取皮下移植瘤组织。

7.免疫组织化学法检测menin、MMP7、Survivin表达：所有标本经10%甲醛固定，石蜡包埋，切片，石蜡切片脱蜡水化后，按照试剂盒所示的操作步骤进行染色，在高倍镜(×400)下随机选择20个视野，计算镜下阳性细胞所占比例。

结 果

1.HSYA对卵巢癌HO-8910PM细胞增殖的影响:卵巢癌HO-8910PM细胞经不同浓度HSYA(50、100、200和400μmol/L)作用24h后，细胞存活率分别为79.3%、63.7%、49.5%和37.6%，与对照组比较，差异有统计学意义(P均<0.01)；HSYA作用卵巢癌HO-8910PM细胞24h后IC50为179.4μmol/L，因此本实验中选取HSYA最佳浓度为200μmol/L。

2.HSYA对卵巢癌HO-8910PM细胞凋亡的影响：200μmol/L HSYA作用HO-8910PM细胞24h后，诱导10.73%±2.38%的HO-8910PM细胞凋亡，与对照组(4.91%±0.15%)比较，差异有统计学意义(P<0.01)。

3.HSYA对卵巢癌HO-8910PM细胞内Nuclear β-catenin、menin、MMP7、Survivin蛋白表达的影响：与对照组比较，HSYA组Nuclear β-catenin、MMP7、Survivin蛋白表达水平均下降(P<0.01，P<0.01，P<0.05)。HSYA组menin蛋白与对照组比较表达水平明显上调(P<0.01，图1)。

图1 HSYA对HO-8910PM细胞Nuclear β-catenin、menin、MMP7、Survivin蛋白表达的影响

4.HSYA对裸鼠卵巢癌皮下移植瘤生长的抑制作用：实验结束后，仔细剥离皮下移植瘤组织并称重，HSYA组肿瘤平均重量为0.66±0.08g，与对照组(1.01±0.18g)比较，瘤重明显减轻(P<0.01)，抑瘤率为34.7%。

5.HSYA对裸鼠肿瘤组织中menin、MMP7、Survivin表达的影响:免疫组织化学染色可见HSYA组肿瘤组织中menin、MMP7和Survivin阳性表达率分别为43.6%±5.1%、11.9%±2.6%和21.3%±1.8%，对照组肿瘤组织中menin、MMP7和Survivin蛋白阳性表达率分别为15.3%±2.7%、29.6%±3.8%和56.1%±4.7%；与对照组比较，HSYA组肿瘤组织中MMP7和Survivin阳性表达率均下降，差异均有统计学意义(P<0.05)；menin阳性表达率明显上调(P<0.01)，详见图2。

图2 HSYA对裸鼠肿瘤组织中menin、MMP7、Survivin表达的影响(×400)

讨 论

HSYA为红花中提取的活血功效成分，具有活血通经，散瘀止痛的作用，有助于局部肿块的消散及改善微循环，增强巨噬细胞的吞噬能力，有利减少肿瘤的转移和扩散[4,5]。在治疗胰腺癌、肠癌、肾癌及宫颈癌等多种恶性肿瘤，均有较多的研究。但在治疗卵巢癌方面研究甚少。

在体外实验中，HSYA能抑制体外卵巢癌HO-8910PM细胞的生长，同时流式检测凋亡表明HSYA能促进卵巢癌细胞凋亡。在体内实验中，建立起卵巢癌移植瘤模型，观察到HSYA可显著抑制卵巢癌移植肿瘤生长。本研究进一步阐述HSYA抗卵巢癌机制的分子机制，可能与Wnt/β-catenin信号通路相关。

Wnt信号通路是一条在进化上高度保守的信号途径，它有着广泛的生物学效应，对细胞增殖、细胞分化、凋亡和坏死等有着重要影响。Wnt/β-catenin信号通路激活时，β-catenin的定位由胞质转为胞核，与转录因子结合启动靶基因的转录，如基质金属蛋白酶(MMP7)、凋亡抑制蛋白(Survivin)、细胞周期蛋白(Cyclin)、原癌基因(C-myc)等基因转录，这些基因能促进恶性肿瘤的发生、发展。β-catenin在Wnt信号通路开放的过程中发挥重要作用，通过检测细胞内β-catenin的表达水平可以判断Wnt/β-catenin信号通路的激活情况[6]。

menin是多发性内分泌腺瘤病1(MEN1)型基因编码的肿瘤抑制因子，MEN1基因主要分布在细胞核中，在细胞质中和端粒附近也有分布。有研究表明，menin与Wnt信号通路有密切关系，menin可以作用于Wnt/β-catenin信号通路中的β-catenin。menin缺失可以导致β-catenin在细胞核内的聚集以及Wnt信号通路的激活；menin可以通过穿梭运动对细胞核内的 β-catenin蛋白进行转运，促进其降解，从而抑制Wnt/β-catenin信号通路的转录活性[7,8]。详见图3。本实验证明，与对照组比较，HSYA组卵巢癌细胞menin蛋白表达显著上调，Nuclear β-catenin蛋白表达明显减少。这表明HSYA可能通过促进menin表达，促进β-catenin降解，减少β-catenin在细胞核内的聚集，从而抑制Wnt/β-catenin信号通路的转录活性，实现其抗卵巢癌机制。为此，本研究进一步检测HSYA是否抑制卵巢癌细胞Wnt/β-catenin信号通路下游癌基因MMP-7、Survivin表达，且MMP-7、Survivin与卵巢癌的恶性程度密切相关。

图3 Wnt/β-catenin信号通路

MMP-7又称为基质溶解素，是MMPs家族中结构最小的成员，由肿瘤细胞及宿主细胞分泌。它既可有效降解基膜成分，又对血管壁和淋巴管的主要成分-弹性蛋白具有分解作用，在肿瘤浸润和转移中起关键作用。它的表达也被认为是一种肿瘤诱导的宿主反应，可以促进肿瘤的生长。Shigemasa等[9]研究表明，MMP-7在卵巢黏液性癌组织的表达比正常组织高。Acar等[10]通过ELISA检测显示，MMP-7可作为卵巢癌恶性程度的一个重要标志物。Sillanpaa等[11]通过对卵巢癌组织的检测及预后随访表明，MMP-7是卵巢癌的一个独立预后预测因子。

Survivin是凋亡抑制蛋白家族成员，具有抑制细胞凋亡和调节细胞增殖的双重作用，在多种恶性肿瘤组织中，包括白血病、淋巴瘤、肺癌、黑色素瘤、卵巢癌、宫颈癌、肾癌等组织中Survivin呈异常表达[12～14]。Survivin的异常高表达预示癌症患者生存率低[15]。许多研究表明，Survivin表达水平与卵巢癌恶性程度密切相关，肿瘤的分化程度越低，则Survivin表达水平越高。Survivin可能通过加快细胞向S期转换，抑制G1期静止，促进癌细胞增殖，增强其迁移侵袭能力，进而促进相应肿瘤的发生转移。

本实验结果表明，HSYA组卵巢癌细胞MMP-7、Survivin蛋白水平均下降，免疫组化结果显示HSYA亦能抑制MMP-7、Survivin蛋白在体内卵巢癌组织中的表达。表明HSYA能抑制MMP-7、Survivin在体内外卵巢癌细胞中过度表达，发挥抗癌作用。HSYA可能通过促进menin表达，减少β-catenin在细胞核内的聚集，其下游的癌基因MMP-7、Survivin表达亦减少，从而抑制卵巢癌细胞的生长。

图4 HSYA作用机制模式图

综上所述，HSYA可能通过促进menin表达，导致β-catenin降解，减少β-catenin在细胞核内的聚集，抑制Wnt/β-catenin信号通路的转录活性，减少下游的癌基因MMP-7、Survivin表达，进而抑制卵巢癌细胞的生长，促进其凋亡(图4)。本研究为临床上应用HSYA治疗卵巢癌提供了实验基础，有一定的临床意义。