丹皮酚对大肠癌细胞增殖、凋亡及自噬的影响

程 玉 李 明 谭诗云 周中银

在全球恶性肿瘤中，大肠癌的发生率位居第4位，病死率位居第2位，每年有超过120万新增病例，并有超过60万病例死亡[1, 2]。外科手术是目前最有效的治疗方法，而对于大肠癌晚期患者，放、化疗则是主要的治疗手段。尽管抗肿瘤治疗不断取得进展，但进展期大肠癌的总体疗效仍不尽如人意。常规传统的化疗药物毒性不良反应较大，对患者生活质量影响也较大，患者耐受差，因此，需要积极探索新的治疗手段。自噬是广泛存在于真核细胞内利用溶酶体降解自身受损的细胞器和大分子物质的过程，是细胞应对恶劣环境的生存机制[3～5]。经研究证实，自噬与肿瘤的发生、增殖、侵袭转移等关系密切[6]。

丹皮酚(paeonol)是一种从牡丹中分离出来的天然酚类化合物，具有多种功效。其药理学活性广泛，镇静催眠、抗炎、抗肿瘤、肝肾保护、降低血糖、免疫调节、心血管保护、抗菌、解热镇痛、抗过敏、抑制血小板聚集和中枢抑制等作用[7～11]。本研究拟观察丹皮酚对大肠癌细胞增殖、凋亡及自噬的影响，并探讨其可能的作用机制。

材料与方法

1.药品试剂:丹皮酚[宁波天真药业有限公司(纯度>98%)]；AnnexinV/PI试剂盒(德国Bender公司)；胎牛血清(美国Gibco公司)；DMEM/F-12培养液及蛋白浓度测定试剂盒(碧云天生物技术研究所)；CCK-8试剂盒(上海同仁化学研究所)；细胞培养瓶、细胞培养皿、96孔及6孔培养板(美国Corning公司)；Bcl-2、Bax、自噬相关基因Atg5、LC3-Ⅱ和Beclin1蛋白及内参β-actin抗体抗体(美国Cell Signaling Technology公司)；辣根酶标记山羊抗兔或山羊抗鼠IgG(武汉博士德生物科技有限公司)。

2.实验细胞：大肠癌LoVo细胞(中国科学院上海细胞库)。主要仪器：Cytoflex流式细胞仪(美国Beckman公司)、Enspire多功能酶标分析仪(美国PerkinElmer公司)、MCO-170MUVL培养箱(日本Panasonic公司)、GloMax 20/20型发光检测仪(美国Promega公司)、LYNX 6000冷冻高速离心机(美国Thermo公司)。实验分组：本实验分为实验组、空白组、对照组，实验组和空白组分别加入浓度为0、30、60、120、240mg/L的丹皮酚，对照组不加丹皮酚。

3.细胞处理：大肠癌LoVo细胞置于含10%胎牛血清的DMEM/F-12培养液中，在37℃、5%CO2饱和湿度条件的恒温箱中孵育，选取处于对数生长期的细胞，消化离心洗涤后重悬。根据不同检测方法调整细胞接种浓度及培养时间。

4.CCK-8法检测细胞活力：将上述处理后的大肠癌LoVo细胞按5×104/ml接种于96孔板，每孔200μl，培养24h至细胞贴壁。将上述贴壁细胞分别加入实验组和空白组中继续培养24、48和72h。到达预定时间后，每孔加入20μl的CCK-8试剂，待培养液显色，用酶标仪测定各孔在450nm处的吸光度值(A值)，根据公式计算细胞存活率(%)=(实验组A值-空白组A值)/(对照组A值-空白组A值)×100%，以细胞存活率表示细胞增殖情况。

5.流式细胞仪检测细胞凋亡率：按1×105/ml浓度将大肠癌LoVo接种至6孔板内，每孔2ml，直至细胞贴壁。将贴壁后的细胞加入不同实验分组中，处理48h后收集细胞，均加入500μl缓冲液进行重悬。各实验分组中分别加入PI及Annexin Ⅴ试剂5μl，避光室温孵育15min，用流式细胞仪检测细胞凋亡率。

6.蛋白质印迹法检测凋亡及自噬相关蛋白:用200μl预冷的含PMSF的蛋白裂解液裂解上述细胞，用移液器反复抽吸后震荡、离心，将上清液移至经高压消毒的EP管内。各组中取40μg等量蛋白行SDS-PAGE电泳，转膜至PVDF膜，用5%BSA封闭，依据蛋白分子量进行相应切割，加入一抗，于室温下孵育，2h后再次洗膜、显色、显影。根据蛋白测定试剂盒说明书检测蛋白质浓度并计算蛋白质含量，采用蛋白质印迹法检测蛋白质表达情况。

结 果

1.丹皮酚对大肠癌LoVo细胞增殖的抑制作用:经不同浓度丹皮酚处理LoVo细胞，分别于24、48、72h后结束培养，CCK-8比色法检测细胞活力。在相同药物浓度下，培养时间越长，细胞存活率越低；在相同作用时间内，丹皮酚药物浓度越高，细胞存活率越低；同对照组(0mg/L)比较，差异有统计学意义(图1)。

图1 丹皮酚对大肠癌LoVo细胞存活率的作用与0mg/L比较，*P<0.05

2.丹皮酚对大肠癌LoVo细胞凋亡的诱导作用：采用PI/Annexin Ⅴ双染标记，流式细胞仪检测细胞凋亡率(图2)。丹皮酚处理48h后可诱导LoVo细胞凋亡，30、60、120mg/L丹皮酚组的细胞凋亡率分别为13.43%±2.34%、22.26%±2.28%和36.25%±3.21%，与对照组的细胞凋亡率3.24%±1.35%比较，差异有统计学意义(P<0.05，图3)。

图2 丹皮酚诱导大肠癌LoVo细胞凋亡散点图A.0mg/L;B.30mg/L;C.60mg/L;D.120mg/L

图3 丹皮酚对大肠癌LoVo细胞凋亡率的作用与0mg/L比较，*P<0.05

3.丹皮酚对大肠癌LoVo细胞凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax表达的作用:丹皮酚(0、30、60、120mg/L)处理LoVo细胞48h后，蛋白质免疫印迹结果显示，随着药物浓度的增加，抗凋亡蛋白Bcl-2表达量逐渐降低，同时促凋亡蛋白Bax的表达量逐渐增加(图4)。

图4 丹皮酚对大肠癌LoVo细胞凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax表达的作用

4.丹皮酚对大肠癌LoVo细胞自噬相关基因Atg5、LC3-Ⅱ和Beclin1蛋白表达的作用:大肠癌LoVo细胞经不同浓度丹皮酚(0、30、60、120mg/L)处理48h后，蛋白质印迹检测结果显示，随着药物浓度的升高，自噬相关基因Atg5、LC3-Ⅱ和Beclin1蛋白表达量逐渐增加(图5)。

图5 丹皮酚对大肠癌LoVo细胞自噬相关基因Atg5、LC3-Ⅱ和Beclin1蛋白表达的作用

讨 论

尽管近年来在肿瘤治疗等方面取得了许多重大进步，新的抗肿瘤药或方案层出不穷，但进展期大肠癌患者的生存率并未明显提高，进展期大肠癌患者的生存率不足2年[12]。因此，新的抗肿瘤方法和策略成为肿瘤治疗研究的重点。

丹皮酚是从中草药牡丹皮中提取的天然酚类化合物，丹皮酚能抑制食管癌、胃癌、乳腺癌、前列腺癌、肝癌、肠癌、皮肤癌等多种恶性肿瘤细胞的增殖；目前对丹皮酚的药理作用已有了一定的了解，但丹皮酚对大肠癌细胞的作用机制仍有待于进一步阐明。本实验不仅观察了不同浓度丹皮酚对大肠癌LoVo细胞增殖、凋亡的影响，还通过自噬相关基因蛋白检测探讨其实现途径可能是通过自噬实现的。

为了观察丹皮酚对大肠癌LoVo细胞增殖和凋亡的影响，首先按照不同浓度梯度进行实验分组，结果显示随着药物浓度的升高，细胞存活率逐渐降低；同时，比较了相同浓度处理不同时间对细胞的抑制作用，结果发现随着作用时间的延长，细胞存活率也逐渐降低，即丹皮酚对大肠癌LoVo细胞的抑制作用呈时间和浓度依赖效应。然后，采用PI/Annexin Ⅴ双染检测丹皮酚对大肠癌LoVo细胞凋亡率的影响，结果发现，随着药物浓度的升高，细胞凋亡率逐渐升高，呈量-效关系。上述两者结果提示丹皮酚可抑制大肠癌LoVo细胞增殖并诱导细胞凋亡。

本实验还对调控细胞凋亡具有重要作用的Bcl-2和Bax蛋白进行了探讨，结果发现丹皮酚处理大肠癌LoVo细胞后，随着药物浓度的升高，抗凋亡蛋白Bcl-2蛋白表达量逐渐降低，且促凋亡蛋白Bax逐渐升高。细胞凋亡过程受凋亡相关蛋白的严格调控，Bcl-2与Bax均属于Bcl-2家族，Bcl-2是细胞凋亡的关键抑制剂，其在多种实体肿瘤中高表达，包括大肠癌，Bcl-2在高分化癌症中的表达更高[13]。Bax能促进细胞凋亡，并且Bax可直接激活死亡效应因子caspase导致细胞凋亡，且Bax与Bcl-2同源，Bax的过度表达可拮抗Bcl-2的抗凋亡效应，促进细胞凋亡，因此，Bax的存在可能与更好的预后相关[14]。

自噬是广泛存在于真核细胞内利用溶酶体降解自身受损的细胞器和大分子物质的过程，自噬的溶酶体降解途径在细胞、组织和机体稳态中发挥着重要作用，控制自噬的基因突变与癌症发生有明确的因果联系。自噬在肿瘤发生、发展的过程中扮演着复杂又重要的角色，是一种细胞生存机制[15]。在形成肿瘤前自噬发挥抑癌作用，但当肿瘤形成后，因缺氧等不利因素，自噬维持肿瘤的生存功能[16]。本研究发现，丹皮酚处理后，大肠癌LoVo细胞自噬相关基因Atg5、LC3-Ⅱ和Beclin1蛋白表达上调，提示丹皮酚可诱导大肠癌LoVo细胞自噬水平升高。

综上所述，经丹皮酚处理后，大肠癌LoVo细胞增殖能力显著降低，细胞凋亡率增加，且抗凋亡蛋白Bcl-2蛋白量表达降低，促凋亡蛋白Bax表达量增加，同时，丹皮酚也可诱导LoVo细胞发生自噬。由此提示丹皮酚可能通过促进大肠癌LoVo细胞自噬抑制细胞增殖并诱导细胞凋亡，丹皮酚对大肠癌具有抗肿瘤作用，为大肠癌的治疗提供了新的治疗策略和方法。丹皮酚对大肠癌肿瘤侵袭的相关性报道仍较少，笔者也将进一步探讨丹皮酚诱导的自噬在细胞增殖、凋亡和侵袭中的作用机制[17]。