环状RNA用于肝细胞癌诊断的Meta分析

田忠昌 褚志杰 杨天保 刘伟峰 杨延辉 孙君军

肝癌是最常见的消化系统恶性肿瘤之一，病死率位居所有肿瘤的第2位[1]。国内最新癌症统计显示，肝癌在男性中的发生率居第3位、病死率居第2位[2]。肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是肝癌最常见的病理类型，占肝癌发病人群的80%以上。早期诊治仍然是提高HCC患者生存预后的重要途径。然而，因临床中缺乏肝癌早期诊断的标志物，大部分HCC患者确诊时已处于中晚期，预后极差[3]。因此，临床中亟待开发新型的肿瘤标志物用于HCC的早期诊断。环状RNA(circular RNA，circRNA)是一类来源于内含子和(或)外显子，通过反向剪接产生、序列保守、具有稳定结构的特殊RNA[4,5]。近年来越来越多的研究证实，circRNA在HCC的发生、进展中发挥重要的生物学功能，提示这些circRNA分子有望成为HCC早期诊断的新型肿瘤标志物[6～14]。本研究拟通过定量的Meta分析，系统性评价circRNA对HCC的综合诊断效能。

资料与方法

1.资料检索策略：检索PubMed、EMBASE、知网(CNKI)、万方、维普等在线期刊数据库，检索时间为建库至2018年12月的中英文文献。检索主题词为 “肝癌”、“肝细胞癌”、 “环状RNA”、“环形RNA”、“诊断”、“circRNA”、“circular RNA”、“hepatocellular carcinoma”、“hepatocellular cancer”、“liver caner”、“diagnosis”等，以单个或组合形式进行检索。

2.纳入与排除标准：①关于circRNA和HCC的相关研究，研究对象为Ⅰ～Ⅳ期的肝细胞癌初诊患者，需经病理确诊；②研究对病例、对照组的类型界定明确，包括具体例数，且病例数不低于20例；③研究的数据可用于直接或间接构建2×2诊断四格表。排除标准：①提供的数据不能构建2×2诊断四格表，且联系作者获取原始数据失败；②评价后的低质量文献；③非临床诊断研究，如基础研究、综述、病例报告、信件、评论、会议摘要、重复发表的论文等。

3.数据提取：两位作者独立提取文献数据资料，包括论文标题、第一作者姓名、发表年份、研究人群、对照组和病例组样本例数、样本类型、circRNA 类型、Cut-off值、内参基因类型、检测方法。提取的数据进行相互核对，不一致之处经讨论解决。

4.文献质量评价：采用QUADAS-2量表工具评价纳入文献质量[15]。分别从“病例选择”、“待评价试验”、“金标准”和“病例流程和进展”等方面进行评价。根据每部分纳入的相关性问题，对应偏倚风险等级判定为 “低(评分1分)”，“高(评分0分)”或“不确定(评分0分)”。

5.统计学方法：通过Meta-Disc 1.4、Stata 12.0软件对数据进行分析。合并的诊断相关统计量包括敏感度、特异性、阳性似然比(PLR)、阴性似然比(NLR)，诊断比值比(DOR)、曲线下面积(AUC)曲线及对应的95%CI。采用Spearman相关系数评估阈值效应引起的异质性，同时经Cochran′Q和I2检验评价非阈值效应来源的异质性大小，P<0.05或I2>50%提示研究间有显著异质性。研究间存在显著异质性时，采用随机效应模型合并统计量，否则采用固定效应模型。通过亚组分析和敏感度分析引起异质性的原因。通过Deek′s定量漏斗图评估发表间偏倚，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1.文献纳入：文献的纳入与排除流程如图1所示，根据检索策略剔除重复文献后，共检索得到相关文献237篇。通过阅读标题和摘要排除205篇，剩余32篇文献进行全文评估，进一步剔除不符合文献22篇(包括综述5篇，预后相关文献10篇及其他非诊断相关文献7篇)，最终纳入关于circRNA与HCC的诊断性文献共10篇。

图1 文献的纳入与排除流程图

2. 纳入文献资料特点和质量评估：纳入文献的特征如表1所示。本研究共纳入HCC病例858例，非癌对照组885例，包含慢性肝炎/肝硬化164例，健康对照88例，匹配癌旁对照412例。所有HCC患者均经过组织病理学检查确诊。所有circRNA分子均经qRT-PCR方法检测，以GAPDH或β-actin 为参照基因。HCC中表达上调的circRNA包括hsa_circ_0091582、hsa_circ_0128298、hsa_circ_000224、hsa_circ_0005075、hsa_circ_16245-1和hsa_circ_0091579等，表达下调的包括hsa_circ_0003570、hsa_circ_0004018、hsa_circ_001565、hsa_circ_000520、Hsa_circ_0001649、circZKSCAN1和hsa_circ_0001445等。采用QUADAS-2条目对纳入文献进行质量评估，纳入的10篇文献评分均≥4分，提示纳入研究的质量相对较高。纳入研究的偏移比例分布情况详见图2。

3.异质性分析：分别通过Spearman相关系数、Cochran-Q值和I2检验评估研究间异质性。整体合并效应量结果显示，Spearman相关系数=-0.084，P=0.741, 表明研究间不存在阈值效应来源的异质性；Cochran′Q=81.24，P=0.000，I2=79.1%。

表1 纳入诊断文献的资料特征

图2 QUADAS-2评价纳入文献的偏移分布

4.诊断性能：如图3所示，circRNA用于诊断HCC的合并敏感度、特异性、PLR、NLR和DOR分别为78%(95%CI：76%～80%)、78%(95%CI：75%～80%)、3.60 (95%CI：2.73～4.75)、0.24(95%CI：0.17～0.34)和17.29(95%CI：10.28～29.07)，受试者工作特征曲线(SROC)曲线下面积(AUC)为0.877。

图3 合并的受试者工作特征曲线(SROC)

5.亚组分析：本研究将不同标本类型、对照类型、circRNA表达状态、内参基因类型和研究人群分别做亚组分析。表2结果显示，以血清为检测基质的circRNA检测诊断HCC的效能优于血浆和组织(敏感度：89% vs 79% vs 74%；特异性：88% vs 65% vs 79%；AUC：0.929 vs 0.724 vs 0.859)；circRNA在区分HCC和健康对照时效能最高(AUC=0.929)，其次为区分HCC和癌旁对照(AUC=0.824)，circRNA用于区分HCC和肝炎/肝硬化时效能最低(AUC=0.730)。基于circRNA表达状态结果显示，表达上调的circRNA表达谱诊断HCC的能力高于下调的表达谱(AUC：0.863 vs 0.836)；在人群分析中，circRNA诊断HCC在非洲人群中的合并AUC为0.929，敏感度为89%，特异性为88%，明显高于亚洲人群。此外，基于GAPDH为内参照的circRNA诊断HCC的效能高于β-actin(AUC：0.859 vs 0.762)。

表2 cirRNA用于HCC诊断时基于不同变量的亚组分析结果

6.敏感度分析：未检测到研究间存在超过上限或下限的离群数据，提示研究间的同质性较高，合并结果较可靠(图4)。

图4 敏感度分析显示研究间的同质性

7.发表偏倚：本研究经Deek′s定量漏斗图评估纳入文献的潜在发表偏倚，P=0.286，说明研究间不存在发表偏倚(图5)。

图5 Deek′s定量漏斗图检测研究发表偏倚

讨 论

肝细胞癌 (hepatocellular carcinoma,HCC)已成为引起死亡的最常见恶性消化系统肿瘤之一[1]。我国是HCC的高发国家，且其发生率呈一定的上升趋势[2]。HCC具有发展迅速、转移快、预后差的特点，因此早期诊断治疗是提高患者预后的重要手段之一[3]。近年来，一些研究证实环状RNA(circular RNA，circRNA)在HCC的诊断中具有潜在的应用价值，但因研究间的样本量、人群等差异，其诊断价值尚存争议。本研究系统性评估了circRNA对HCC的综合诊断效能，为circRNA更好地用于HCC临床诊断提供循证医学证据。

本研究对目前已经报道的circRNA分子进行Meta分析。共纳入诊断性研究共10篇，包含HCC病例858例，非癌对照组885例。通过系统性分析，对HCC中表达上调的circRNA包括hsa_circ_0091582、hsa_circ_0128298、hsa_circ_000224、hsa_circ_0005075、hsa_circ_16245-1和hsa_circ_0091579等，以及表达下调的circRNA分析包括hsa_circ_0003570、hsa_circ_0004018、hsa_circ_001565、hsa_circ_000520、Hsa_circ_0001649、circZKSCAN1和hsa_circ_0001445等进行统计量合并，得到总体circRNA表达谱的效应模型。结果显示，circRNA用于诊断HCC的合并敏感度和特异性均为78%，受试者工作特征曲线(SROC)曲线下面积(AUC)为0.877，提示整体的诊断效能较高。此外，阳性似然比PLR为3.60提示HCC患者中circRNA表达异常改变的概率是对照组的3.6倍；阴性似然比为0.24，提示假阴性的概率较低。诊断的比值比(DOR)是评价一项诊断实验检验效能的重要指标之一，其值越大，提示诊断的诊断效能越高，当DOR的值<1时，提示一项检测的诊断效能很低[16]。本研究中获得的DOR为17.29，提示整体的诊断效能很高。以上数据充分显示，异常表达的circRNA可很好应用于HCC诊断。

本研究进一步将不同标本类型、对照类型、circRNA表达状态、内参基因类型和研究人群分别做亚组分析，也得到很多有意义的结果。以血清为检测基质的circRNA检测AUC可达0.929，效能明显优于血浆和组织，提示血清可作为circRNA表达检测的很好的样本类型。目前已有证据证实不同样本类型来源的游离核酸对肿瘤诊断的差异[17,18]。本研究另外发现circRNA在区分HCC和健康对照时效能最高(AUC=0.929)，其次为区分HCC和癌旁对照(AUC=0.824)，circRNA用于区分HCC和肝炎/肝硬化时效能最低(AUC=0.730)。此外，笔者发现表达上调的circRNA表达谱诊断HCC的能力稍高于下调的表达谱(AUC：0.863 vs 0.836)。在人群分析中，circRNA诊断HCC在非洲人群中的诊断效能明显高于亚洲人群。此外，基于不同内参基因的亚组分析GAPDH较β-actin可能更利于诊断性的circRNA检测分析。

本项Meta分析仍存在一定局限性：(1)纳入分析的10项研究大部分来自中国，得到的结论可能存在一定的地域人群差异性，且纳入的非洲人群仅为埃及人群，缺乏一定代表性。(2)研究间存在一定的异质性，因此本结果不能完全准确反映circRNA在HCC中的综合诊断价值。(3)亚组分析尽管得到一些新的结论，但因分组后样本量减小，再次合并后可能导致有些偏移增大。因此，还有待于开展大样本、高质量的研究进一步证实。