抗钠-钙交换体α-2(840-877)单克隆抗体3F10的制备及其预处理对大鼠缺血性心律失常的抑制作用①

王苗苗 陈依春 白晓洁 马瑞君 封启龙

(山西医科大学生理学系，细胞生理学山西省重点实验室，太原 030001)

心律失常是缺血性心血管疾病常见的一种临床表现，是心源性猝死的主要原因(约占80%)[1]，其中室速、室颤等恶性心律失常尤为多见。目前临床应用的抗心律失常药物大多属于广谱性离子通道阻断剂，在发挥治疗心律失常作用的同时，可能存在潜在的致心律失常风险[2]。钠-钙交换体(Na+-Ca2+exchanger,NCX)在心肌细胞上高度表达，是维持心肌细胞钙稳态的重要离子交换体，在大多数情况下，NCX将钠离子和钙离子以3∶1的比例逆向转运。有研究证实，缺血性心脏病中，钠-钙交换体功能上调导致钙超载，由前向钠-钙交换产生的内向电流是引起心律失常的重要原因，因而与缺血性心律失常的发生密切相关[3,4]。

心脏NCX包括位于N端的α-1和C端的α-2两个肽段，其中α-2肽段是由第7跨膜片段、第8跨膜片段的胞内部分以及7、8跨膜片段之间的连接环组成[5]。研究表明，α-2序列在不同种属的NCX分子间以及同一种属不同亚型NCX间高度保守[6]。大量研究表明[7,8]，α-2肽段是NCX 发挥功能的关键肽段。基于此，本研究拟选用化学合成的NCXα-2(840-877)肽段，免疫小鼠制备抗NCX 单克隆抗体。α-2(840-877)抗原肽段对应于NCX分子第840～877位氨基酸残基，由于其本身分子较小(约3.79 kD)，免疫原性相对较弱，故采用与血蓝蛋白(KLH)偶联的方法免疫小鼠制备抗体。在此基础上进一步观察该抗体预处理对结扎冠脉前降支导致的缺血性心律失常的作用。为分析其作用机制，利用膜片钳技术观察抗体对大鼠心肌细胞NCX正向和反向电流的影响。

1 材料与方法

1.1材料 BALB/c小鼠，雌性6～8周龄，SD大鼠，雄性，240 g左右，由山西医科大学动物中心提供。NCX α-2重复序列840～877肽段(第840～877位序列为ALGTSVPDTFASKVAATQDQYADASIGNVTGSNAVNVF)(上海吉尔生化有限公司)。试剂：RPMI1640培养基(美国Hyclone公司)，FBS(cellmex)，弗氏佐剂、Ouabain、taurine、K2-ATP、Nifedipine、4-AP、L-Glutamic等(美国Sigma公司)，考马斯亮蓝蛋白定量试剂盒(上海美吉生物医药科技有限公司)；胶原酶P(德国Bochringer Mannhein公司)；其他试剂为国产分析纯药品。台氏液、酶液、KB液、Na+/Ca2+交换电流(INa/Ca)细胞外液和细胞内液(mmol/L)的配制:见参考文献[5]。主要仪器：抗原亲和柱(Phamacia)，酶标仪(美国Molecular Devices公司)，CO2恒温孵育培养箱(美国Themo公司)，灌流装置(美国Ala Scientific Instruments Inc公司)，膜片钳仪器(美国Axon Instruments公司)，Langendorff心脏灌流装置(澳大利亚AD Instruments公司)。

1.2方法

1.2.1NCX α-2(840-877)肽段与载体蛋白KLH偶联与免疫 将KLH与交联剂SMCC混合，室温旋转反应30 min，使KLH充分活化。用多肽偶联缓冲液平衡的SephadexG-25柱层析除去游离成分。将多肽加入已活化的KLH中室温旋转反应2 h，偶联好的产物作为抗原用来免疫动物[9]。免疫动物前取一定量偶联抗原与弗氏完全佐剂(首次免疫)或不完全佐剂(加强免疫)充分混匀为稳定的乳状液，于第1、21、35天用肌肉注射法主动免疫BALB/c小鼠。免疫后第7天取少许小鼠尾静脉血检测血清效价。

1.2.2细胞融合与抗体筛选 选取免疫血清效价高的小鼠进行细胞融合。融合前3 d再加强免疫1次。无菌分离免疫鼠脾脏，制备脾细胞悬液后与SP2/0骨髓瘤细胞融合。第30天运用间接ELISA法进行阳性克隆筛选、3次亚克隆后获得阳性克隆株。将杂交瘤细胞接种于含有10%胎牛血清的RPMI1640培养基中进行扩大培养。

1.2.3腹水型单抗制备与鉴定 采用动物体内诱生法制备腹水型单抗。BALB/c小鼠腹腔注射石蜡油预处理1～2周后，每只小鼠腹腔接种(1～2)×106个杂交瘤细胞，随细胞在腹腔增殖，2～3周后可见小鼠腹部明显膨隆，产生大量含有单克隆抗体的腹水。腹水经抗原亲和柱纯化后运用间接ELISA法和SDS-PAGE法进行抗体效价和抗体浓度的检测。

1.2.4大鼠离体缺血性心律失常的记录 55 mg/kg戊巴比妥钠麻醉大鼠，开胸游离心脏后悬挂于Langendorff灌流装置上，以台氏液37℃恒温经主动脉逆行灌流心脏，待心脏稳定后记录心电图。结扎冠状动脉左前降支(LAD)，造成局部缺血30 min，统计30 min期前收缩发生的个数，室速和室颤的发生率、持续时间。实验分为3组：①伪手术组(Sham)：LAD下只穿线不结扎，台式液持续灌流；②缺血组(Ischemia)：结扎LAD 30 min，台式液持续灌流；③抗体预处理+缺血组：结扎LAD 前5 min改用含10 μg/ml NCX-3F10抗体的台式液灌流。

1.2.5大鼠在体缺血性心律失常的记录 55 mg/kg 戊巴比妥钠麻醉大鼠，固定于鼠板后行气管插管，BL420生物机能系统记录大鼠Ⅱ导联心电图。在心尖搏动处分离胸部肌肉，在左侧第3～4肋间做0.5 cm切口，暴露心脏。于左心耳根部边缘约2 mm 处以缝合线下穿LAD并结扎，缺血15 min，心电图显示ST段抬高(≥ 0.15 mV)为缺血结扎成功。统计15 min期前收缩发生的个数，室速和室颤的发生率、持续时间。实验分为3组：①伪手术组(Sham)：LAD下只穿线不结扎，尾静脉注射1 ml生理盐水；②缺血组(Ischemia)：结扎LAD 15 min；③抗体预处理+缺血组：结扎LAD 前5 min尾静脉注射50 μg/kg NCX-3F10抗体。

1.2.6大鼠单个心室肌细胞的分离 参照本实验室建立的分离方法[10]。大鼠麻醉后，快速开胸游离心脏，修剪后经主动脉逆行悬挂于Langendorff灌流装置上并固定，台式液恒温恒压灌流心脏8 min后换为酶液循环灌流15 min，待心室肌发白后剪取心尖组织于KB液中剪碎吹打，200目铜网过滤得到单个心室肌细胞，室温静置2 h左右进行实验。

1.2.7NCX α-2(840-877)抗体3F10对正常心肌细胞INa/Ca的作用 将2滴细胞置于细胞槽中，贴壁5 min，台式液灌流3 min。镜下选取折光好、纹理清晰的短杆状单个心室肌细胞作为实验对象。玻璃微电极充灌内液后，进入标本槽中，接触细胞膜表面进行封接、破膜。Whole Cell状态下，钳制电位为-40 mV，从+60 mV到-120 mV，2 s内完成，电压刺激的速率为90 mV/s，用NiCl2(5.0 mmol/L)特异性地阻断Na+/Ca2+交换电流，NiCl2阻断前后的电流差即为Ni2+敏感Na+/Ca2+交换电流。

2 结果

2.1单克隆杂交瘤细胞株的建立 以与KLH偶联的NCX α-2(840-877)肽段为抗原免疫小鼠，经细胞融合和阳性克隆筛选获得一株可稳定分泌抗NCX α-2(840-877)单克隆抗体的杂交瘤细胞株，将其命名为杂交瘤细胞3F10。

2.2抗NCX α-2(840-877)单克隆抗体效价及纯度检测 经动物体内诱生法制备腹水型单抗。ELISA结果显示，亲和纯化后的抗NCX α-2(840-877)单克隆抗体3F10抗体效价为1∶40 960。SDS-PAGE凝胶电泳鉴定该抗体纯度，结果如图1所示，在分子量为25 kD和50 kD左右的位置可见清晰的抗NCX α-2(840-877)单克隆抗体3F10轻链、重链条带，与IgG标准品一致，无杂带，抗体纯化效果良好。经Bradford法检测3F10抗体浓度为1.62 mg/ml。

图1 抗NCX α-2(840-877)单克隆抗体3F10纯度检测结果Fig.1 Results of monoclonal antibody 3F10 against NCX α-2(840-877) purityNote:1.Protein marker;2.Purified antibody 3F10 against NCX α-2(840-877).

2.3抗NCX α-2(840-877)单克隆抗体3F10对离体成年大鼠心脏缺血性心律失常的抑制作用 研究结果显示，缺血前给予NCX-3F10抗体(10 μg/ml)预处理后可明显抑制大鼠离体心脏缺血性心律失常的发生。与伪手术组相比，缺血组大鼠100%发生室速，77.78%出现室颤(P<0.05)。缺血前给予NCX-3F10抗体预处理后，大鼠的室速发生率下降至25%，室速的持续时间也有明显的缩短(P<0.05)，见表1。

图1 抗NCX α-2(840-877)单克隆抗体3F10纯度检测结果Fig.1 Results of monoclonal antibody 3F10 against NCX α-2(840-877) purityNote:1.Protein marker;2.Purified antibody 3F10 against NCX α-2(840-877).

2.4抗NCX α-2(840-877)单克隆抗体3F10对成年大鼠在体心脏缺血性心律失常的抑制作用 实验结果显示，缺血前给予NCX-3F10抗体(50 μg/kg)预处理后可明显抑制麻醉大鼠缺血性心律失常的发生。与伪手术组相比，缺血组大鼠100%发生室性心律失常，以频发的室早、室速、室颤为主(P<0.05)。缺血前给予NCX-3F10抗体预处理后，与模型组相比，大鼠室速、室颤的发生率、持续时间和室早的数目均明显减少(P<0.05)，见表2、图2。

表2 抗NCX α-2(840-877)单克隆抗体3F10对大鼠在体心脏缺血性心律失常的影响Tab.2 Effects of monoclonal antibody 3F10 against NCX α-2(840-877) on ischemia-induced rat arrhythmias in vivo

图2 抗NCX α-2(840-877)单克隆抗体3F10对在体大鼠心脏缺血性心律失常的抑制作用Fig.2 Inhibition of monoclonal antibody 3F10 against NCX α-2(840-877)on ischemia-induced arrhythmias in vivo in ratsNote:A.ECG tracings in rats of different groups.3F10.Tracing from antibody 3F10(50 μg/kg)-preconditioned experiment;B:a.Normal ECG tracing;b.Premature ventricular beats(VPB);c.Ventricular tachycardia(VT);d.Ventricular fibrillation(VF)；3F10.Anti-α-2(840-877) antibody-3F10.

2.5抗NCX α-2(840-877)单克隆抗体3F10对大鼠心室肌细胞钠-钙交换电流(INa/Ca)的抑制作用 研究结果显示，NCX-3F10(10 μg/ml)抗体对INa/Ca有显著抑制作用。当钳制电位为+50 mV时，外向钠-钙交换电流由(3.23±0.05)降至(2.14±0.03)pA/pF(n=6，P<0.05)；当钳制电位为-100 mV时，内向钠-钙交换电流由(-5.57±0.13)降至(-3.41±0.06)pA/pF(n=6，P<0.05)，见图3。

图3 抗NCX α-2(840-877)单克隆抗体3F10对大鼠心室肌细胞的Na+/Ca2+交换电流的抑制作用Fig.3 Inhibition of monoclonal antibody 3F10 against NCX α-2(840-877)on Na+/Ca2+ exchange current(INa/Ca) in rat ventricular myocytesNote:A.Current-voltage relationship before(a,control)and after(b) application of 10 μg/ml antibody against α-2(840-877)，after (c) application of 5.0 mmol/L NiCl2;B.Ni2+ sensitive INa/Ca before(a-c)and after(b-c)application of 10 μg/ml antibody against α-2(840-877).

3 讨论

在哺乳动物中，NCX包括NCX1、NCX2、NCX3三种亚型，分布在多种组织细胞膜上。根据心肌细胞NCX 10次跨膜的新式结构模型[11]，NCX第7次跨膜段之后的α-2重复序列可能暴露于细胞膜外侧。NCX分子内部α-2重复序列的高度保守性提示[12]，α-2肽段在NCX的离子转运中发挥重要作用。本实验中化学合成的免疫原是由38个氨基酸组成的NCX α-2(840-877)肽段，其分子量仅为3.79 kD，免疫原性也相对较弱。有文献报道，将小分子多肽与血蓝蛋白KLH偶联后，可显著增加其免疫原性[13]。本研究为提高NCX α-2(840-877)抗原肽段的免疫原性，将血蓝蛋白KLH与NCX α-2(840-877)肽段进行偶联后免疫BALB/c小鼠，获得了稳定分泌抗NCX α-2(840-877)单克隆抗体3F10的杂交瘤细胞株，为进一步研究该抗体功能奠定了基础。

心律失常是缺血性心血管疾病常见的一种临床表现，严重威胁着人类生命健康。缺血性心律失常主要是由于心肌血供和氧供不足，ATP减少和酸中毒，使心肌细胞内H+增加，进而通过Na+-H+交换将H+排出胞外，同时导致细胞内Na+浓度([Na+]i)升高。由于此时胞内ATP减少使钠-钾泵活动受限，致使细胞内Na+大量蓄积，进而激活反向NCX转运增强(钠外排、钙进入)，造成细胞内钙超载。当胞内Ca2+增加后，将激活前向模式的钠-钙交换活动增强，由此产生的一过性内向电流是引起后除极和心律失常发生的重要电生理机制[14]。本研究利用大鼠离体和在体缺血性心律失常模型证实，NCXα-2(840-877)肽段的单克隆抗体3F10对缺血性心律失常具有显著抑制作用，膜片钳实验结果进一步表明，其抗心律失常作用与该抗体抑制心肌钠-钙交换活动有关，这一研究结果证实了NCX分子内α-2肽段可作为今后治疗心律失常的潜在靶点，为今后靶向NCX预防和治疗缺血性心律失常提供了必要的实验依据，同时也为将来开发抗心律失常抗体药物奠定了重要的实验基础。