糖尿病难愈性创面大鼠实验模型的研究进展

樊炜静，柳国斌

(1.上海中医药大学，上海 200032； 2.上海中医药大学附属曙光医院，上海 200032)

糖尿病难愈性创面是目前糖尿病较为常见的严重并发症，严重者可导致截肢的发生[1]。研究调查显示有30%的糖尿病患者会继发皮肤溃疡，且80%以上的患者在创面愈合后会出现复发[2-4]。周围神经病变、周围血管病变和感染是糖尿病难愈性创面常见的危险因素。近年来，糖尿病难愈性创面的发生率明显升高，不仅给许多患者和家庭带来了经济负担，也给国家带来了巨额的医疗花费[5-6]。

随着临床研究者和患者对健康的重视和对生活质量要求的提高，糖尿病难愈性创面的治疗已经成为一项迫在眉睫的工作，而建立正确合理的动物模型有利于研究者对糖尿病难愈性创面进行更加深入的研究，为疾病的治疗、药物的研发提供便利。目前已经有较多类型的糖尿病难愈性创面动物模型被建立[7-8]。相对于兔、猪、狗等动物模型[9-10]，大鼠在研究中最容易获得，易于饲养和管理。本文就国内外学者对糖尿病难愈性创面大鼠实验模型的研究进行总结，归纳各模型的优势和不足，从而为后续研究者对糖尿病难愈性创面大鼠实验模型的研究提供思路。

1 糖尿病常规创面模型

糖尿病常规创面模型的构建主要以临床特征，即糖尿病场面外在形态的构建为主，通常方法较为简单，可复制性较强[11]。一般分为糖尿病模型的构建和创面模型的构建两部分，其创面模型的构建多为外部破坏，其用时较短，易于观察，但与真实的糖尿病创面差距较大，在临床中仅适合单一因素的观察，应用范围较窄。

1.1 全层皮肤切除法

李友山等[12]使用高脂饲料联合STZ方法建立2型糖尿病大鼠模型，在大鼠背部标记创面面积后直接剪除标记区域皮肤，深达筋膜，这种方法操作简单，易于复制，创面面积可控，应用最为广泛。李巧芬等[13]使用Wistar大鼠注射STZ建立糖尿病大鼠模型，在大鼠背部使用打孔器打孔，深入筋膜层，3 d后创面出现肉芽生长视为建模成功。打孔器的使用使创面面积和创面深度的量化更为准确。

1.2 低温诱导法

任萍萍等[14]使用STZ诱导糖尿病大鼠模型建立慢性创面模型，使用冰块模拟冬季环境，将大鼠放置于泡沫保鲜箱中，大鼠足部隔塑料板接触冰袋，前三天使箱内温度保持在6 ℃，后7天保持在10 ℃左右，观察大鼠足部变化，出现溃疡即为造模成功。陈群力等[15]则采用控制室温，逐渐降温的方式制造大鼠皮肤创面。这种方法使用低温诱导的方法造成大鼠足部缺血缺氧，继而出现红肿、出血、溃疡，贴合糖尿病创面的临床发展过程，但操作难度较大，大鼠死亡率较高，创面情况不可控，难以进行实验研究，临床推广性较低。

1.3 高温烫伤法

TIAN等[16]使用STZ方法建立糖尿病大鼠模型，6周后将大鼠置于烫伤板，大鼠皮肤出现红肿、渗出的创面则为造模成功。TAKHTFOOLADIM等[17]则利用电子烫伤仪对糖尿病大鼠进行烫伤创面的造模，HE染色可观察到深Ⅲ度烫伤则代表造模成功。黄仁燕等[18]使用恒温恒压烫伤仪进行创面的造模，不仅纠正了之前烫伤方法造成的创面形状、面积不固定的问题，也使得定量测评分析变得更方便。

2 糖尿病缺血性创面模型

糖尿病性周围血管病变导致的组织缺氧、营养障碍是糖尿病创面出现的直接原因，对于缺血模型的建立主要有直接血管阻断和间接压迫两种方式[19]，同时通过激光多普勒进行下肢血流测定，对创面周围缺血的状态进行评估和监测，也使得缺血性创面模型的建立更加精准。

2.1 皮肤磁片压迫法

葛良鹏等[20]利用STZ诱导后的糖尿病大鼠模型，将磁片植入大鼠前肢皮下，将外源磁片放置于对应位置皮外，利用磁片之间吸引力形成的压力制造皮肤缺血，每次2 h后恢复血流30 min，循环4 d，以皮肤变黑变硬、针刺不出血为造模成功的标志。这种方法建立的创面模型创面面积基本可控，与磁片面积保持一致，利于进行定量分析，但皮下植入的操作易造成感染，一方面增加造模操作难度，另一方面有诱发感染性创面的风险。DUSCHER等[21]对其方式进行了改良，对糖尿病大鼠的背部皮肤进行牵拉，将磁片放置于皮肤两侧，每天12 h连续压迫，21 d内通过观察皮肤状况确定造模是否成功。

2.2 动脉结扎离断法

KIM等[22]将糖尿病大鼠的股动脉进行结扎，并离断远端所有分支动脉，成功建立糖尿病缺血性溃疡模型，但这种方式造成的急性缺血与真实糖尿病创面的形成过程差异太大。李文惠等[23]对前人的方式进行改良，使用STZ诱导糖尿病大鼠模型，结扎离断股动脉及其主要分支，保留部分侧枝动脉供血，并使用SQL-5Q烫伤仪烫伤缺血下肢皮肤，一方面造成不完全缺血状态模拟糖尿病创面缺血状态，另一方面通过人为创面缩短造模时间。

3 糖尿病感染性创面模型

感染是糖尿病创面延期愈合的重要原因，目前糖尿病足溃疡感染病原菌主要分为革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌、真菌三大类，金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌分别是革兰氏阳性球菌和革兰氏阴性球菌感染最多的菌种[24-27]，目前方法主要以创面菌株涂抹和皮下菌株注射为主。

3.1 大肠埃希菌感染的糖尿病创面模型

黄仁燕等[28]使用STZ诱导雄性SD大鼠糖尿病后，先使用恒温恒压烫伤仪在大鼠背部下端皮肤进行接触烫伤，以烫伤处出现红肿、水泡为标准，HE染色可观察到深度Ⅱ度烫伤代表糖尿病创面模型建模成功，48 h后在创面皮下注射大肠埃希菌悬液，48 h后取局部分泌物做菌培养，检测出不耐药细菌或机会感染菌即为造模成功。

3.2 金黄色葡萄球菌感染的糖尿病创面模型

韩强等[29]使用高脂饲料喂养雄性SD大鼠8周后，使用STZ诱导糖尿病，在大鼠背部下端皮肤使用恒温恒压烫伤仪建立体表烫伤模型，创面皮肤接种金黄色葡萄球菌悬液，48 h后创面分泌物菌培养中检测出不耐药细菌代表建模成功。这种高脂饲料联合STZ方法建立的创面模型更大程度地模拟了2型糖尿病的发病过程，在一定程度上能够避免单纯由于STZ杀死胰岛β细胞形成的1型糖尿病。

4 糖尿病神经病变性创面模型

糖尿病性周围神经病变是糖尿病创面重要的诱发因素之一，自主神经和感觉神经的异常均可导致溃疡的发生。目前糖尿病神经病变性创面的模型较少，建立主要以神经离断的方式为主，JIN[30]和KALE等[31]通过手术分离并结扎坐骨神经的方式构建神经病变的模型，7 d后大鼠出现自发性溃疡。在理论状态下这种方式首先通过大鼠较长时间高血糖状态的保持以造成机体病理改变的发生，继而通过神经破坏加速病变，最终形成溃疡，能够较好模拟糖尿病溃疡的发生发展过程。但该方式自发诱导创面出现的可能性较小，往往需要结合组织破坏的方式。

5 糖尿病慢性创面模型

创面延期愈合是糖尿病创面的重要临床特点，如何能够较好地模拟糖尿病创面的病理过程、构建延期愈合的创面模型也是研究的难点之一，目前延期愈合模型构建的方法以免疫抑制为主。彭艳等[32]使用STZ诱导Wistar大鼠构建糖尿病模型后，通过射线照射的方法抑制大鼠的免疫功能，后结扎股动脉，观察双下肢皮肤，出现溃疡则为造模成功。张东萍等[33]则通过对Wistar糖尿病大鼠腹腔注射3%的猪胃黏蛋白以降低大鼠机体的免疫力，延缓创面的愈合过程，相比其他方法更好地模拟了糖尿病免疫功能抑制状态下多种病原微生物混合感染对糖尿病足发展的影响，更利于实验的观察。

6 糖尿病难愈性创面中医药实验模型

辨证论治是中医治疗的根本原则之一，症候模型的建立对中医基础研究的发展有极大的推动作用。通过中医理论在普通糖尿病慢性创面的基础上从创面观察和大鼠症状上构建阳虚阴证模型，不论是从病理因素还是临床特征，都更符合糖尿病难愈性创面的特点。但目前各类中医证型糖尿病难愈性创面大鼠模型的构建方式还存在一定问题，主要还是以自行激发为主，诱导的方式不足，部分证型大鼠模型造模成功率太低。

6.1 糖尿病难愈性创面阴证模型

李媛[34]、蒙玉娇等[35]探索性使用STZ、皮肤缺损、激素干预、塑料环创面边缘埋置等多因素复合的方法构建糖尿病大鼠皮肤创面阴证模型，通过使用激素等方式使创面的状态更接近临床中难愈性创面的状态、延缓创面愈合，大鼠出现蜷缩、尾冷、大便糖稀、创面分泌物多，渗液清稀，肉芽组织红而不泽等整体或局部阳虚的表现，与临床中糖尿病足溃疡的表现相近。糖尿病难愈性创面在中医属于阴证的范畴，患有糖尿病难愈性创面的病人在全身症状和创面局部症状中均能见到阳虚的表现[36-38]。

6.2 肾阴虚型糖尿病难愈性创面大鼠模型

张红英等[39]对SD大鼠禁食不禁水后12 h后注射STZ溶液和甲状腺素构建糖尿病大鼠模型，甲状腺素用以加速阴虚症候的发展，如大鼠cAMP/cGMP比值升高，空腹血糖值≥11.1 mmol/L，出现形体消瘦、体毛无光泽、活动增加、反应迟钝、肛门红肿、大便干结色黑等症状则视为肾阴虚模型造模成功。

6.3 脾气虚型糖尿病大鼠模型

颜刚等[40]在对SD大鼠注射STZ溶液后进行高脂饲料喂养，7 d后测空腹血糖，如大鼠同时出现倦怠、懒动、大便时软时溏、游泳耐力下降、体毛光亮度减退，则视为脾气虚型糖尿病大鼠模型成功。

6.4 阴虚内热型糖尿病大鼠模型

吴晏[41]和扶丽君等[42]则系统建立了糖尿病大鼠阴虚内热证型的行为学评分标准，通过对高脂喂养和STZ诱导后SD大鼠的动物神态、行为、背部温度、二便情况、舌、爪、活动状态等方面综合对糖尿病大鼠阴虚内热的表现进行评估。通过症状学的判断更加符合中医诊断的过程，是目前最为常用且较为合理的方法，但缺乏可量化数据的支持。

6.5 阴虚血瘀型糖尿病大鼠模型

杨明华等[43]先使用高糖高脂的饲料使大鼠有血瘀型糖尿病的前期准备，同时通过喂甲状腺素片加速阴虚进程，最后注射ALX，使大鼠同时具备胰岛素抵抗和阴虚血瘀的特点，通过对大鼠饮水、被毛、体温、环磷酸腺苷含量判断大鼠的阴虚状态，通过凝血时间、血液黏度、血浆NO含量等判断大鼠的血瘀状态，成功构建阴虚血瘀型糖尿病大鼠模型。

7 讨论与展望

目前糖尿病难愈性创面大鼠实验模型的建立均为多步骤进行，糖尿病模型和皮肤创面模型的先后建立也符合疾病发生发展的病理过程。糖尿病模型建立的方法众多，基因敲除及转基因动物模型发展迅速, 但因其价格高昂并不是研究者的首选。目前以STZ法诱导应用最为广泛，但通过高糖高脂饮食诱导大鼠胰岛素抵抗后再注射 STZ 的方法，可以损伤胰岛功能，引起血糖升高，更贴合2型糖尿病的发病过程。皮肤磁片压迫法通过较长时间的压力造成局部皮肤缺血缺氧，进行形成皮肤坏死性创面，烫伤法建立的糖尿病创面同样属于慢性创面，同样具有延期愈合的特点。相比之下，动脉结扎离断法建立的急性缺血模型与糖尿病创面的缺血病理过程并不一致。细菌原株种植的方式构建糖尿病感染性创面模型，在操作上相对简单，但有研究表明，伤口细菌感染对创面组织有双重作用，大量重度感染能够延缓创面愈合，少量轻度感染则可以加快创面愈合，因此可控性较低，在未来的研究中应对创面面积和细菌种植浓度的比例进行量化。

在糖尿病动物皮肤创面模型建立后, 还要保证其慢性难愈性等病理特征是较为困难的，也是目前糖尿病创面模型进一步提高的核心问题。在糖尿病难愈性创面大鼠实验模型的构建中使用激素是目前较为流行的方式，一方面可以维持组织的低免疫状态，另一方面可以起到延缓创面愈合，构建慢性创面的作用。但慢性难愈性创面的构建仍存在许多难以模拟的因素，如老龄化等，慢性创面的愈合速度与年龄之间的关系已经被证实，未来老龄化大鼠的培育相信会给相关模型的建立带来新的可能。

当前阶段糖尿病难愈性创面大鼠模型的制备主要以模拟各类病理因素和临床特征，但仅仅是简单的叠加，而非病理过程的自然转化，创面的形成也多由外部破坏，而非自发性形成溃疡，这些都是需要在未来解决的问题。糖尿病难愈性创面的病理过程是复杂的，疾病发展过程中的表现多样，构建正确合理的大鼠模型需要考虑诸多因素。单因素的模型制备相对简单，但与人类糖尿病难愈性创面的真实表现有较大差异，因此多因素模型的制备应该是未来发展的趋势。而目前多因素模型多为病理因素结合临床特征两方面进行制备。对于临床特征的观察，中医往往有更为细致的观察和独特的角度，中西医结合的思路，不仅能准确把握糖尿病难愈性创面“病”的特点，也能综合糖尿病难愈性创面“证”的因素，可以最大程度模拟糖尿病难愈性创面的疾病特点，满足各类实验的要求。