布地奈德对脂多糖诱导大鼠急性肺损伤的影响

罗园 岳红云 李世元

1河北医科大学附属人民医院呼吸科,石家庄050011;2河北医科大学附属人民医院烧伤科,石家庄050011

急性肺损伤 (acute lung injury,ALI)是由于非心源性原因引起的肺组织结构发生特征性的病理改变,其未控制后会进一步进展至急性进行性呼吸衰竭。ARDS是一种急性、弥漫性的炎症性肺损伤,为常见的危及人类健康的呼吸危重症之一,重症ARDS患者在ICU病死率为40%～50%[1]。ALI/ARDS因治疗效果差,给社会和患者家庭带来了沉重的经济负担[2]。目前主要治疗策略为抑制全身炎症反应、呼吸支持治疗等。布地奈德作为一种吸入糖皮质激素,推测对于ALI有治疗作用。目前,有关吸入布地奈德对ALI的研究较为热门,但对于其具体作用机制,仍未完全阐释清楚。因此,本研究通过应用脂多糖 (lipopolysaccharides,LPS)建立大鼠ALI模型,观察经气道应用布地奈德对ALI大鼠的保护作用,并初步探讨其可能机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料 LPS(美国Sigma公司);布地奈德混悬液 (阿斯利康制药有限公司,批号:320499);健康雄性Sprague Dawley(SD)大鼠30只,体质量 (200±10)g(河北医科大学实验动物中心,合格证编号1605205)。Evans蓝 (美国Sigma公司);BCA蛋白定量试剂盒 (美国Thermo公司)。细胞间黏附分子1(intercellular adhesion molecule 1,ICA M-1)(美国Abcam公司)。IL-1β酶联免疫吸附试验 (enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)试剂盒 (上海欣博盛公司)。

1.2 检测仪器 动物呼吸机 (美国Harvard公司,型号687);Odyssey双色红外荧光成像仪(美国LI-COR公司);Synergy-HT多功能酶标仪(美国Bio-Tek公司);双目显微镜 (日本Olympus公司)。

1.3 实验方法

1.3.1 动物分组 动物实验方法经河北医科大学伦理委员会审核通过。取健康清洁雄性SD大鼠30只,随机分为3组:对照组、LPS组和布地奈德组,每组10只。对照组气道注入生理盐水1 ml;LPS组气道注入LPS(5 mg/kg);布地奈德干预组气道注入相同剂量LPS 24 h后,气道注入布地奈德1 ml(500μg/kg)。

1.3.2 标本制作 给予药物干预后24 h,麻醉,开胸,游离气管和肺脏,结扎右主支气管,取材,右肺上叶浸入4%多聚甲醛中固定,进行病理及免疫组织化学检测,右肺下叶用于计算肺部湿干重比。左肺用4℃PBS灌洗,每次3 ml,共3次(回收率＞80%),回收的支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)于4℃离心10 min(1200r/min,离心半径13.5cm)后,上清液留存至-80℃保存,进行炎症因子及蛋白含量检测。离心沉淀制成细胞悬液后,用细胞计数板在光镜下计数,统计白细胞、上皮细胞等,细胞悬液图片经瑞氏染色后,光镜下根据形态学标准分类计数500个细胞。

1.3.3 检测指标

1.3.3.1 病理学检查 取右肺上叶,10%福尔马林固定24 h,常规石蜡包埋,5μm切片后进行HE染色并做肺部病理结构改变分析。采用Smith评分对肺组织有无毛细血管淤血、肺泡腔纤维蛋白渗出、中性粒细胞渗出、气道黏膜上皮细胞脱落、肺泡间隔增宽等5项的轻重程度进行评分,每个标本分析10个高倍视野,取其平均值计算肺损伤评分。

1.3.3.2 免疫组织化学检测ICAM-1表达 取石蜡标本,行4μm连续切片,梯度酒精脱蜡复水,常规修复抗原处理后孵育ICA M-1一抗 (1∶3 000)4℃过夜,同时以PBS代替一抗做阴性对照。孵育二抗 (1∶2 000)后DAB显色,苏木精复染细胞核,中性树脂封片,光镜下观察ICAM-1阳性表达情况。

1.3.3.3 肺水清除率的测定 用1%戊巴比妥以2～3 ml/kg腹腔麻醉,气管切开后进行气管插管,接动物呼吸机,吸纯氧行容量控制通气,潮气量为9～10 ml/kg,呼吸频率为80～100次/min。用恒温仪保持大鼠体温为37℃。灌注液由5%牛血清蛋白及0.15 g/L Evans蓝溶液配置。经气管插管将灌注液以4 ml/kg缓慢灌入大鼠肺内,同时行机械通气。1 h后放血处死动物。将肺组织整块取下,以采样管吸取右肺下叶内的肺泡液体0.2 ml,在波长620nm处测定Evans蓝标记的白蛋白浓度,计算肺水清除率。肺水清除率=(Vi-Vf)/Vi×100%,Vf=Vi×Pi/Pf,式中Vi和Vf分别代表起始和最终肺泡液体总量,Vi表示灌注前,Vf表示孵育后,P表示Evans蓝标记的白蛋白浓度。

1.3.3.4 肺湿干重比测定 取右肺下叶,滤纸吸干表面水分后称量重量,置于96℃恒温箱烤48 h至肺组织重量恒定后称量重量,计算肺湿干重比。

1.3.3.5 ELISA检测IL-1β表达水平 应用ELISA试剂盒,采用双抗体夹心法,依次加入标准品及样品、生物素化抗体工作液、酶结合工作液、显色剂、终止液,应用酶标仪,即刻测量OD450(3 min内),在仪器保存读数结果。以标准品的浓度为横坐标,OD值为纵坐标,绘出标准曲线。根据样品OD值,由标准曲线查出所测样品浓度。

1.4 统计学分析 采用SPSS 21.0统计软件对所有数据进行统计分析。计量资料以±s表示。符合正态方差齐的计量资料采用单因素方差分析(One-way ANOVA),进一步两两比较采用LSD法;不符合正态或方差不齐的计量资料采用非参数检验 (Kruskal-wallis Test)。P＜0.05为差异有统计学意义。统计图表绘制使用Graphpad软件进行。

图1 各组大鼠肺组织病理表现 A:对照组;B:脂多糖组;C:布地奈德组 HE ×200

2 结果

2.1 各组大鼠肺组织病理表现 HE染色结果(图1)可见对照组肺组织结构完整,肺泡壁无水肿,无炎性细胞渗出;LPS组肺泡结构破坏,肺间质水肿,肺泡壁明显增厚,炎症细胞渗出,肺泡腔内可见少量水肿液渗出;布地奈德组肺组织结构破坏较LPS组明显减轻,炎症细胞渗出减少,肺泡渗出明显减少,与对照组相比,肺泡结构破坏略增多。依据Smith评分,布地奈德组肺组织损伤评分较脂多糖组明显减低 (图2)。

2.2 各组大鼠肺组织中ICAM-1表达 免疫组织化学结果 (图3)显示,对照组肺组织可见少量淡黄色颗粒;LPS组可见肺泡间大量棕黄色颗粒聚集,较对照组明显增多;布地奈德组可见少量散在淡染黄色颗粒,与LPS组相比明显减少。黄色颗粒为ICA M-1免疫组织化学染色阳性表达颗粒。

2.3 各组大鼠肺水清除率 LPS组肺水清除率(14.80%±0.97%)较对照组 (29.98%±0.54%)明显减低 (P＜0.01),布地奈德组肺水清除率(24.10%±1.27%)较LPS组明显升高 (P＜0.01)。见图4。

图2 各组大鼠肺损伤评分的比较

2.4 各组大鼠肺湿干重比 LPS组肺湿干重比(6.35±0.21)较对照组 (3.99±0.07)升高 (P＜0.01),布地奈德组肺湿干重比 (5.28±0.12)较LPS组减低 (P＜0.05)。见图5。

2.5 各组大鼠BALF中蛋白含量及细胞计数LPS组BALF中蛋白含量 [(0.85±0.06)g/L]较对照组 [(0.25±0.02)g/L]升高 (P＜0.01),布地奈德组BALF中蛋白含量 [(0.47±0.04)g/L]较LPS组降低 (P＜0.05)。见图6。

图3 各组大鼠肺组织中细胞间黏附分子1表达 A:对照组;B:脂多糖组;C:布地奈德组 免疫组织化学染色 ×200

图4 各组大鼠肺水清除率的比较

图5 各组大鼠肺湿干重比的比较

LPS组BALF中细胞总数 [(10.62±0.36)×106/ml]较对照组 [(4.10±0.11)×106/ml]明显升高 (P＜0.01),布地奈德组BALF中细胞总数 [(6.03±0.13)×106/ml]较LPS组减低(P＜0.01)。见图7。

LPS组BALF中中性粒细胞 [(8.71±0.32)×106/ml]较对照组 [(0.38±0.11)×106/ml]明显升高 (P＜0.01),布地奈德组BALF中中性粒细胞 [(4.44±0.31)×106/ml]较LPS组减低(P＜0.01)。见图8。

图6 各组大鼠BALF中蛋白含量的比较

图7 各组大鼠BALF中细胞总数的比较

LPS组BALF中巨噬细胞 [(2.07±0.08)×106/ml]较对照组 [(0.31±0.06)×106/ml]明显升高 (P＜0.01),布地奈德组BALF中巨噬细胞 [(1.35±0.04)×106/ml]较LPS组减低(P＜0.01)。见图9。

图8 各组大鼠BALF中中性粒细胞的比较

图9 各组大鼠BALF中巨噬细胞的比较

2.6 各组大鼠BALF中IL-1β表达水平 LPS组BALF中IL-1β表达水平 [(598±36.65)ng/L]较对照组 [(214±20.52)ng/L]升高 (P＜0.01),布地奈德组BALF中IL-1β表达水平[(406.5±20.03)ng/L]较LPS组明显减低 (P＜0.01)。见图10。

3 讨论

在过去的几十年中,ALI的病理生理机制及治疗均有广泛深入的研究,可是直到目前为止,ALI/ARDS患者的病死率仍居高不下[3]。ALI的主要病理改变为广泛的肺泡上皮细胞及毛细血管损伤、肺毛细血管通透性增加、肺泡蛋白水肿液渗出、炎性细胞浸润、肺水肿形成,导致气体交换障碍,引起进行性发展的难治性低氧血症及呼吸困难[4]。本实验通过给予布地奈德干预LPS致ALI大鼠,观察相关指标变化,发现布地奈德可以减少肺泡结构破坏,减少BALF中炎症因子IL-1β产生,降低蛋白水肿液、中性粒细胞、巨噬细胞的渗出,减少肺部炎症反应的发生,对于ALI存在保护作用。

图10 各组大鼠BALF中IL-1β水平的比较

肺水清除率在治疗急性肺水肿中扮演了很重要的角色,肺水平衡是通过肺泡上皮细胞的钠通道[5]、氯通道、Na+-K+-ATPase介导的离子梯度差来维持[6]。在新生儿及成人的肺脏中,糖皮质激素均可以调节钠和水的转运。血液中激素水平对于维持肺水平衡和肺水清除是十分重要的。糖皮质激素与细胞质内受体结合,信号传导入细胞核内,特异性上调气道上皮钠通道mRNA水平,引起气道上皮钠通道表达增多[7],从而增强肺水清除,改善肺损伤。此外,有实验表明在地塞米松干预后的H441气道上皮细胞中,Na+-K+-ATPase的α1、β1亚基表达蛋白均有升高,且增强了钠通道的转运能力[8]。既往实验多通过气道注入或腹腔、静脉注射地塞米松干预ALI进程,对于通过气道给予布地奈德的干预实验研究较少。布地奈德为糖皮质激素之一,与地塞米松相比,有较少的垂体肾上腺素轴抑制不良反应,且气道给予,外周入血量极低,能更好地发挥治疗作用,减少不良反应的发生。为了明确布地奈德对于ALI的影响,设计本实验,结果证明通过布地奈德治疗后,肺水清除率较LPS组明显下降,对于减轻肺水肿有积极意义。

ICAM-1为免疫球蛋白家族中的一种表面黏附分子,其分布十分广泛,包括上皮细胞、血管内皮细胞、成纤维细胞、单核巨噬细胞等。其主要功能为介导细胞间的黏附,促进炎症细胞的迁移和趋化[9]。相关研究显示,ICAM-1的异常表达参与了ALI发生发展和患者预后转归。该分子可以介导炎性细胞如中性粒细胞等与肺泡毛细血管上皮细胞聚集黏附,诱发炎症反应,造成肺组织炎性损伤。一些细胞因子,如IL-1β、核转录因子κB等可促进ICAM-1的表达。近期实验发现,在A549细胞中,IL-1β可以增强ICAM-1启动子与p65的结合力,从而上调ICAM-1 mRNA的表达[10-11]。本实验发现,布地奈德治疗后,肺组织中IL-1β水平降低,进而肺组织中ICAM-1的表达减少,提示布地奈德可以减轻炎症因子产生及炎症因子迁移、趋化。

综上所述,气道给予布地奈德干预治疗LPS诱导的ALI,其机制可能与抑制BALF中炎性因子生成、炎性细胞浸润及趋化、改善肺水清除率有关。布地奈德对ALI的治疗作用机制需要在临床试验中进一步探讨。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突