盲肠结扎穿刺和脂多糖诱导大鼠急性呼吸窘迫综合征模型的建立和分析

朱艳 齐倩 孟丽 周晨明 徐海博

1河北医科大学电镜实验中心,石家庄050017;2河北医科大学法医学教研室,石家庄050017;3河北医科大学第二医院呼吸内科,石家庄050000

ARDS是一种临床表现为急性低氧血症和进行性加重的呼吸困难的临床综合征。尽管在ARDS发病机制方面的研究取得了很大进展,但病死率仍高达30%～40%[1]。因此,建立理想可靠的动物模型对研究其发病机制、病理改变等有着重要的意义。临床中ARDS的发生、发展通常由多种致病因素联合导致,目前研究认为其发病机制除原发病因造成肺损伤外,还存在手术创伤、肠道细菌毒素入血等 “二次打击”因素[2-4]。目前ARDS动物模型包括气管、腹腔或尾静脉注射脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)、油酸,盲肠结扎穿刺(cecal ligation and puncture,CLP)等[5]。气管、腹腔或尾静脉注射LPS由于操作简便而被广泛应用,但单纯的LPS所致的损伤难以模拟人类ARDS,且不能持久。CLP能较好地模拟脓毒症导致出现肺部急性期损伤表现而用于相关研究[6]。本研究通过检测炎性指标以及对肺组织进行病理形态学检查,分析和比较CLP、LPS单因素诱导与CLP和LPS联合诱导形成 “二次打击”建立的ARDS模型的异同,探索建立稳定可靠、更能模拟人类ARDS的发病过程的动物模型。

1 材料与方法

1.1 动物 SPF级雄性SD大鼠176只,体质量210～230 g,由河北医科大学动物中心提供。本实验经河北医科大学伦理委员会审核通过。

1.2 试剂与仪器 主要试剂:大肠杆菌LPS血清型 O111:B4(Sigma-Aldrich,美 国),IL-1β、IL-6和肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)酶联免疫吸附试验试剂盒 (Thermo Fisher,美国)。主要仪器:体积描记器 (EMMS,英国),低温离心机 (Thermo,美国),全自动血细胞分析仪 (Sysmex,日本),透射电子显微镜(日立H-7500,日本)。

1.3 方法

1.3.1 ALI/ARDS模型制备 176只SD大鼠随机分为CLP组、LPS组、CLP+LPS组和对照组,每组44只。CLP组行CLP,大鼠术前12 h禁食不禁水,10%水合氯醛按1 mg/kg腹腔注射将其麻醉,仰位固定,备皮消毒。于大鼠腹正中处切开1 cm切口,进腹找到盲肠,1号丝线结扎1/2盲肠,以20G针头在游离端对穿2次 (4个孔)后送回腹腔,缝合切口。置笼内自由活动,不禁饮食。LPS组尾静脉注射LPS(2 mg/kg)。CLP+LPS组行CLP 30 min后,尾静脉注射LPS(2 mg/kg)。对照组开腹暴露盲肠后缝合,尾静脉注射生理盐水2 ml/kg。每组分为4个亚组,每组11只,用于在损伤诱导后4、12、24、48 h检测各项呼吸功能、炎性指标和病理组织学观察。

1.3.2 评估呼吸功能 观察大鼠的紫绀、呼吸窘迫情况。在每个时间间隔,每个亚组存活的大鼠中随机选6只置于体积描记器中,以测量呼吸频率和潮气量。

1.3.3 支气管肺泡灌洗液 (bronchoalveolar lavage fluid,BALF)中炎性指标检测 大鼠处死后,结扎右侧肺门,用4℃生理盐水对左侧支气管肺泡进行灌洗,每次2.5 ml,缓慢重复3次,将收集的BALF离心 (4℃,离心半径30 cm,1 000 r/min,10 min),取上清,按照试剂盒说明书操作,测定BALF中TNF-α、IL-1β和IL-6的水平。将BALF离心后的细胞重悬计数,用血细胞分析仪测定白细胞计数、多形核白细胞百分比,用BCA试剂盒测定总蛋白含量。

1.3.4 肺组织湿干重比 处死剩余存活大鼠,切除左肺并立即称重,然后在90℃的培养箱中干燥24 h后重新称重,计算湿干重比。

1.3.5 肺组织病理变化 取右肺组织4%多聚甲醛固定,脱水、石蜡包埋,切片后HE染色,镜下观察肺组织病理变化。

1.3.6 透射电镜观察 取右肺组织 (1 mm×1 mm×3 mm)4%戊二醛固定后,进行常规透射电镜样品制备:1%四氧化锇固定,丙醇逐级脱水,梯度渗透,环氧树脂812包埋。用莱卡UC7超薄切片机进行超薄切片,醋酸双氧铀和柠檬酸铅双重染色,在日立H-7500型透射电镜下观察,加速电压为80 kV。

1.4 统计学分析 采用SPSS 20.0软件进行统计分析。计量资料以±s表示,计数资料以百分率表示。运用单因素方差分析 (One-way ANOVA),然后用Bonferroni法进行事后检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠死亡率及表征的比较 CLP组大鼠在术后12 h出现呼吸急促,伴有明显的呼吸窘迫和紫绀,并在24 h出现死亡率峰值 (27.3%)。在LPS组中,刺激后4 h呼吸显著加快,伴有呼吸窘迫和紫绀,在12 h出现最大死亡率 (18.2%),在24 h死亡率降到9.1%。CLP+LPS组中,4 h左右大鼠开始出现呼吸窘迫症状,24 h达到高峰,48 h刺激后仍然明显。对照组大鼠未见呼吸窘迫、紫绀或死亡。见表1。

2.2 各组大鼠呼吸频率比较 各组大鼠呼吸频率见表2。

表2 各组大鼠呼吸频率比较 (±s,n=6)

表2 各组大鼠呼吸频率比较 (±s,n=6)

注:CLP为盲肠结扎穿刺;LPS为脂多糖;与对照组比较,a P＜0.05;与LPS组比较,b P＜0.05;与CLP+LPS组比较,c P＜0.05

组别 呼吸频率 (次/min)4 h 12 h 24 h 48 h对照组 73±12 70±8 69±4 65±6 CLP组 90±7 abc 119±16 ac 142±19 ab 93±11 a LPS组 117±10 a 139±17 a 89±11 c 70±8 c CLP+LPS组 127±9a 158±22 a 161±26 a 113±15a

2.3 各组大鼠肺水肿指标比较 各组大鼠BALF中总蛋白含量和肺组织湿干重比见表3、4。

表3 各组大鼠BALF中总蛋白含量的比较 (±s,n=6)

表3 各组大鼠BALF中总蛋白含量的比较 (±s,n=6)

注:BALF为支气管肺泡灌洗液;CLP为盲肠结扎穿刺;LPS为脂多糖;与对照组比较,a P＜0.05;与CLP+LPS组比较,b P＜0.05

组别 总蛋白 (g/L)4 h 12 h 24 h 48 h对照组 2.71±0.82 2.83±0.51 2.97±0.76 2.37±0.91 CLP组 2.96±0.88 b 3.37±0.74 4.65±1.03 a 2.84±0.81 LPS组 4.14±0.78 a 4.69±1.01 a 3.12±0.94 b 2.95±1.02 CLP+LPS组 4.81±0.97a 5.28±0.74a 6.24±1.91a 3.12±0.88

2.4 各组大鼠BALF中肺损伤相关指标比较 见表5。

2.5 肺组织病理形态学观察 CLP+LPS组4 h可观察到肺泡间隔增宽,肺间质水肿,肺泡腔内有液体渗出,12、24 h均可见大量炎症细胞浸润,肺泡腔有大量渗出液,肺间质明显充血水肿,肺泡结构紊乱,48 h病理损伤减轻。CLP组大鼠4 h肺组织基本未变化,12 h出现轻度损伤,24 h损伤最重。LPS组大鼠4 h肺组织出现病理损伤,12 h损伤最重,24 h好转。对照组大鼠肺泡结构完整,无损伤表现。24 h各组大鼠肺组织病理表现见图1。

2.6 肺组织电镜观察 CLP+LPS组12、24 h肺损伤严重,可观察到Ⅱ型肺泡上皮细胞损伤,胞质、核质水肿,内质网扩张、脱颗粒,线粒体肿胀,线粒体嵴和膜融合不清。CLP组24 h、LPS组12 h损伤最重,但肺损伤比CLP+LPS组24 h轻,可观察到线粒体轻度肿胀,核周间隙轻度增宽。24 h各组大鼠电镜观察见图2。

表4 各组大鼠肺组织湿干重比的比较 (±s)

表4 各组大鼠肺组织湿干重比的比较 (±s)

注:CLP为盲肠结扎穿刺;LPS为脂多糖

组别肺湿干重比4 h 12 h 24 h 48 h对照组 3.31±0.88（n=5） 3.65±1.25（n=5） 3.50±0.97（n=5） 3.87±0.48（n=5）CLP组 3.96±0.71（n=4） 4.39±0.69（n=4） 5.28（n=2） 4.03±0.73（n=4）LPS组 4.22±0.64（n=4） 4.35±0.69（n=3） 3.81±0.68（n=4） 3.99±0.69（n=5）CLP+LPS组 4.15±0.59（n=4） 4.86±0.55（n=3） 5.27（n=2） 4.19±1.1（n=3）

表5 各组大鼠肺损伤相关指标比较 (±s,n=6)

表5 各组大鼠肺损伤相关指标比较 (±s,n=6)

注:CLP为盲肠结扎穿刺;LPS为脂多糖;与对照组比较,a P＜0.05;与LPS组比较,b P＜0.05;与CLP+LPS组比较,c P＜0.05

组别 多形核白细胞百分比 (%)白细胞 (×104/μl)4 h 12 h 24 h 48 h 4 h 12 h 24 h 48 h对照组 39.43±11.37 40.21±10.08 43.25±12.39 35.51±15.77 1.11±0.03 0.92±0.08 0.81±0.05 0.72±0.06 CLP组 42.35±6.09 48.67±8.09c 63.17±6.49a 36.17±9.28 1.53±0.92bc 6.35±1.07a 8.57±3.42ab 1.68±0.76 LPS组 57.17±5.98a 64.19±7.15a 47.77±6.78c 35.15±9.18 5.87±4.56a 7.19±2.41a 2.18±0.93c 1.03±0.56 CLP+LPS组 59.45±7.09a 82.57±6.07a 84.02±7.15a 43.77±3.87 6.45±3.91a 8.79±2.11a 11.44±8.21a 2.31±1.14组别 肿瘤坏死因子α（ng/L）4 h 12 h 24 h 48 h IL-6（ng/L）4 h 12 h 24 h 48 h对照组 93.28±4.15 83.79±3.51 84.22±3.28 85.32±3.64 5.49±1.76 5.41±1.07 4.46±0.87 4.35±0.93 CLP组 102.98±47.56c 256.45±50.32a 327.53±74.26ab 112.35±43.63 6.77±5.59bc 15.83±8.24abc 39.76±9.17ab 21.49±7.46ab LPS组 187.49±40.34a 272.34±54.59a 115.32±31.50ac 93.45±20.49 18.57±7.65a 28.36±7.49a 11.61±8.51ac 6.52±6.89c CLP+LPS组 209.76±56.89a 312.87±54.69a 447.23±99.38a 108.34±39.32 21.96±9.62a 32.79±9.16a 47.87±8.76a 28.79±5.97a

3 讨论

建立理想的ARDS动物模型对研究其发病机制及防治有重要意义。理想的动物模型应该复制人类肺损伤的发生机制和病理生理改变。据报道,70%的临床ARDS病例与脓毒症相关[7]。CLP可模拟临床感染引发脓毒血症从而导致肺部损伤的致病过程,被用于建立ARDS动物模型。但有研究表明CLP不单独引发肺损伤,而是通过联合其他刺激造成 “二次打击”来促使肺损伤的发生[8]。LPS是内毒素的主要成分,进入机体后激活巨噬细胞释放促炎因子,肺作为最敏感的器官之一最先受到损伤,肺血管通透性增加,组织液渗出,促使ARDS的形成[9-10]。但单纯的LPS所致的损伤难以模拟人类复杂的ARDS病理生理过程,且不能持久[11]。本研究尝试在大鼠中实施CLP和尾静脉注射LPS联合诱导,形成 “二次打击”来建立稳定的肺损伤模型。其理论基础是:第1次刺激 (严重创伤或感染等)引起机体全身炎症反应综合征,机体敏感性增高,此基础上第2次刺激 (细菌感染等)引发全身炎症反应综合征失控,体内炎症反应和抗炎反应失衡,机体发生ARDS,甚至多器官功能障碍综合征。在前期实验中,以常规动物模型剂量的LPS(5 mg/kg)与CLP联合诱导损伤后4 h内是致死的。因此,笔者尝试降低LPS的剂量,使用2 mg/kg的LPS和CLP相结合。在该模型中,大鼠出现了与ARDS发展相关的临床、生物化学和组织病理学变化。其中炎症反应与呼吸窘迫的关系十分密切[12]。机体受到损伤刺激后,释放大量的炎性因子 (如TNF-α、IL-6等)[13],炎性因子可激活巨噬细胞及中性粒细胞等效应细胞,导致肺泡上皮细胞和血管内皮细胞损伤,血管通透性升高,出现肺水肿[14]。而BALF中的蛋白含量及肺湿干重比则是反映肺水肿程度的指标。本研究中,与CLP组、LPS组和对照组相比,CLP+LPS组12 h和24 h的呼吸频率、TNF-α、白细胞、多形核白细胞百分比、IL-6水平显著升高。CLP组呼吸窘迫症状、炎症指标、肺水肿指标和肺病理损伤在12 h出现升高,在24 h达到峰值,48 h降低。LPS组上述指标在4 h即出现升高,12 h达到高峰,24 h下降,大鼠呼吸窘迫症状好转,48 h呼吸窘迫基本消失。CLP组大鼠呼吸窘迫出现时间晚但持续时间长,LPS组出现时间早但恢复快,联合诱导组结合了二者的优点,产生持续至少24 h的呼吸窘迫,肺损伤比单种刺激模型更严重,并且24 h死亡率接近临床ARDS的死亡率 (30%～40%)[1]。因此,在建立模型时还应考虑此因素,至少要3～4只以上的大鼠。综上所述,笔者建议行CLP,然后尾静脉注射LPS诱导大鼠出现呼吸窘迫,在24 h时各项ARDS的症状和指标达到高峰,比单独行CLP或使用LPS更能模仿ARDS的病理过程,是一种较为理想的动物模型。

图1 24 h各组大鼠肺组织病理表现 HE ×400 A:对照组;B:CLP组;C:LPS组;D:CLP+LPS组

图2 24 h各组大鼠肺组织在透射电镜下的损伤差异 A:对照组;B:CLP组;C:LPS组;D:CLP+LPS组

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突