难治性高血压患者血管紧张素原、血管紧张素Ⅱ1 型受体、质膜Ca2+- ATP 酶1 基因多态性研究

高佳儿 魏文娟 黄建振 彭俊 张静 陆云燕

难治性高血压是一种特殊类型的高血压，是多种遗传因素和环境因素共同作用引起的复杂性疾病。相对于血压控制的高血压患者，难治性高血压患者有着更明显的靶器官损害，并且心血管事件发生风险明显增加[1-2]。目前国内外对于原发性高血压致病基因的研究有了较多发现[3-6]，但对于难治性高血压相关基因多态性的研究却较少。Lynch 等[7]发现血管紧张素原（angiotensinogen，AGT）基因两个单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）位点变异与欧洲裔美国人难治性高血压相关，与非洲裔美国人却无相关性，提示该基因多态性与难治性高血压的关系可能存在人种差异。国内目前鲜有相关研究。本研究选取高血压最重要的发病机制之一的肾素-血管紧张素-醛固酮系统中2 个重要的高血压候选基因：AGT 基因两个SNP 位点rs699 与rs5051、血管紧张素Ⅱ1 型受体（angiotensin Ⅱtype 1 receptor，AGTR1）基因1 个SNP 位点rs5186 及国外研究较多的质膜Ca2+-ATP 酶1（plasma membrane calcium ATPase isoform 1，ATP2B1）基因1 个SNP 位点rs12817819 为研究目标，旨在发现难治性高血压患者的基因多态性，以及基因多态性与环境危险因素交互作用对难治性高血压形成的影响，现报道如下。

1 对象和方法

1.1 对象 选择2016 年10 月至2018 年12 月在本院就诊的难治性高血压患者（RH 组）59 例，其中男39 例，女20 例，年龄32～84（57.26±13.29）岁；非难治性高血压患者（非RH 组）77 例，其中男41例，女36 例，年龄36～86（58.36±12.70）岁。RH 组纳入标准：服用包括利尿剂在内的3 种降压药物，收缩压仍持续＞140mmHg，和（或）舒张压＞90mmHg，或需要4 种及以上降压药物才能控制血压的患者[8-9]。排除标准：继发性高血压患者，高血压合并急性脑血管意外患者，高血压合并妊娠患者，高血压合并恶性肿瘤患者。

1.2 方法

1.2.1 一般资料采集 两组患者均留取清晨空腹肘静脉血样，30min 内分离血浆并于-20℃保存。测量身高、体重、腰围和血压等，计算体重指数（BMI），采集吸烟、饮酒史。所有生化指标由本院检验科同批次专人检测，包括空腹血糖、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、尿酸、血肌酐、同型半胱氨酸（Hcy）等。

1.2.2 基因多态性位点的检测及分析 抽取空腹EDTA 抗凝的静脉血300μl，应用血液基因组DNA抽提试剂盒（美国Axygen 公司生产）提取基因组DNA，严格按试剂盒说明书操作。采用直接测序法对所有研究对象的目标SNP 位点进行基因型检测。将需要检测的SNP 位点作为靶序列，根据SNP 位点两侧的保守序列设计引物，引物设计合成以后（由上海派森诺生物科技股份有限公司合成），确认DNA 模板质量合格的情况下，使用BI-2720 PCR 扩增仪进行扩增，扩增条件按试剂盒说明书设定，PCR 产物纯化后应用美国ABI 3730XL DNA 自动测序仪进行基因分型（由上海派森诺生物科技股份有限公司协助完成）。比较两组患者基因多态性位点，与并Hap Map 数据库进行比较。1.3 统计学处理 采用SPSS 19.0 统计软件，符合正态分布的计量资料以表示，比较采用t检验，偏态分布的以M（1Q1，Q3）表示，比较采用非参数检验。计数资料以百分率表示，比较采用χ2检验。两组的基因频率分布是否符合哈迪-温伯格（Hardy-Weinberg，H-W）遗传平衡定律采用χ2检验进行分析。采用logistic 回归模型分析难治性高血压的独立相关因素及基因多态性与其他相关因素交互作用对难治性高血压的影响。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组患者一般资料比较 见表1。

由表1 可见，两组腰围、BMI、空腹血糖、尿酸比较差异均有统计学意义（P＜0.05 或0.01）；其余指标比较差异均无统计学意义（均P＞0.05）。

表1 两组患者一般资料比较

2.2 两组患者AGT、AGTR1、ATP2B1 基因代表性SNP 位点最小等位基因频率的比较 见表2。

由表2 可见，两组AGT、AGTR1、ATP2B1 基因代表性SNP 位点最小等位基因频率与国际人类基因组单体型图（HapMap）中国人群分布的特点相符合。两组AGT、AGTR1、ATP2B1 基因代表性SNP 位点基因型频率分布符合H-W 遗传平衡定律（P＞0.05），样本具有群体代表性。

2.3 两组患者各SNP 位点基因型分布的差异比较见表3。

表2 两组患者AGT、AGTR1、ATP2B1 基因代表性SNP 位点最小等位基因频率的比较

表3 两组患者各SNP 位点基因型分布的差异比较[n（%）]

由表3 可见，两组AGT 基因位点rs699、rs5051基因型频率比较差异均有统计学意义（均P＜0.05），AGTR1、ATP2B1 基因SNP 位点差异均无统计学意义（均P＞0.05）。

2.4 基因多态性及环境因素与难治性高血压的关系分析 见表4。

表4 基因多态性及环境因素与难治性高血压的关系分析

由表4 可见，经logistic 回归校正性别、年龄、腰围、空腹血糖、血脂、血肌酐、血Hcy 水平后显示，尿酸、BMI、rs699（CC）基因型、rs5051 基因型（TT）基因型是难治性高血压均的独立危险因素（P＜0.05 或0.01）。

2.5 rs699、rs5051 位点基因多态性与环境因素交互作用对难治性高血压的影响 logistic 回归分析显示rs699、rs5051 单核苷酸多态性与空腹血糖交互作用对难治性高血压的影响有统计学意义（OR=1.143，95%CI：1.014～1.288，P＜0.05），但校正性别性别、年龄、吸烟、腰围、BMI、血脂、血肌酐、血Hcy 水平、尿酸等因素后，上述影响不再有统计学意义（均P＞0.05）。

3 讨论

随着人口老龄化以及肥胖、睡眠呼吸暂停低通气综合征的增多，难治性高血压人群日益庞大，已成为影响国民健康的棘手问题。美国的高血压患者中，难治性高血压比例占15%～18%[10-11]，而我国高血压患者将近2.7 亿[12]，血压达标率却不足10%。

难治性高血压的发病机制目前尚未完全明确，既往研究提示与多种因素相关，如交感神经过度激活、肾素-血管紧张素-醛固酮系统激活、炎症反应、氧化应激和内皮细胞功能紊乱等相关[13-14]。到目前为止，关于遗传方面的研究有限，Givens 等[15]研究发现一种特殊的细胞色素P450 CYP3A4 基因，该基因与美国非裔难治性高血压的发生有关。另外一项关于欧洲裔美国人及西班牙人的研究发现，ATP2B1基因位点rs12817819 的A 等位基因与难治性高血压显著相关[16]。本研究未发现位点rs12817819 与难治性高血压存在相关性。提示该基因多态性与难治性高血压的关联性存在人种或种族间的差异。这与前文Lynch 的研究结果相似。本研究结果显示，AGT基因位点rs699、rs5051 基因型频率在RH 组和非RH 组间的比较，差异有统计学意义。经logistic 回归校正性别、年龄、BMI、空腹血糖、血肌酐等因素后显示，rs699（CC）基因型、rs5051（TT）基因型是难治性高血压的独立危险因素。

难治性高血压的发生是遗传基因与环境因素相互作用的结果，具有病因的多元性和复杂性，很可能受到多个基因位点及环境危险因素的共同影响[17]。本研究显示，RH 组腰围、BMI、空腹血糖、尿酸与非RH组的差异具有统计学意义。logistic 回归分析显示尿酸、BMI 是难治性高血压的独立危险因素。此外本研究采用交互作用模型理论，探讨AGT 基因位点rs699、rs5051 分别与腰围、BMI、空腹血糖、尿酸交互作用对难治性高血压的影响。logistic 回归分析结果显示，AGT 基因位点rs699 及rs5051 与空腹血糖交互作用对难治性高血压产生的影响有统计学意义，但校正性别、年龄、腰围、BMI 等因素后，上述影响不再有统计学意义。

综上所述，AGT 基因位点rs699（CC）基因型、rs5051（TT）基因型是难治性高血压发病的一个重要因素，另外尿酸、BMI 亦是难治性高血压的危险因素，但未发现基因多态性与环境因素的交互作用对难治性高血压形成产生影响。本研究为难治性高血压遗传学研究提供了相关信息，但由于样本量较小，会产生一定的局限性，未来有待于更大样本量更多基因位点的研究来揭示难治性高血压遗传学方面的病因。