不同介质对真姬菇菌种保藏效果的对比*

朱华玲，班立桐，黄 亮，王 玉，杨红澎，孙 宁

（1.天津农学院基础科学学院，天津 300384；2.天津农学院农学与资源环境学院，天津 300384）

真姬菇（Hypsizygus marmoreus)又名玉蕈、斑玉蕈、海鲜菇等，属担子菌亚门（Basidiomycotina）层菌纲（Hymenomycetes） 伞菌目（Agaricales） 白蘑科（Tricholomataceae） 离褶菌科（Lyphyllaceae） 玉蕈属（Hypsizygus），是一种优良的食用菌，其味比平菇鲜，肉比滑菇厚，质比香菇韧，口感极佳，是不可多得的食药兼用的可工厂化生产的珍稀食用菌之一[1-5]，其产量仅次于金针菇与杏鲍菇，是食用菌市场的主力军[6]。菌种是真姬菇生产中至关重要的生产资料，妥善保藏菌种的意义重大。选择一种合适的保藏真姬菇菌种的介质，可提高菌种的品质和效益[7-12]。通过对比22种不同介质对真姬菇菌种的保藏效果，以期为真姬菇菌种的简单有效保藏提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料与仪器

真姬菇菌种HB-1斜面母种，由天津农学院食用菌研发中心提供；马铃薯淀粉与葡萄糖混合物（质量比 1∶4）；溴百里酚蓝（bromothymol blue，BTB）；3-（4，5-二甲基-2-噻唑） -2，5-二苯基溴化四唑〔3-(4，5-dimethyl-2-thiazolyl)-2，5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide,thiazolyl blue tetrazolium bromide，MTT〕，二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）；琼脂；磷酸二氢钾；硫酸镁；石膏；葡萄糖；NaCl；聚乙二醇；矿泉水；纯净水；超纯水；蒸馏水；栎木；杨木；腐木；麸皮。化学药品均为分析纯。

恒温振荡培养箱，上海精密仪器仪表公司；超净工作台，北京亚泰科隆仪器技术有限公司；紫外可见分光光度计，上海析谱仪器有限公司；水分测定仪，江苏维科特仪器仪表有限公司；立式压力蒸汽灭菌器，上海三申医疗器械有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 水溶液保藏

将蒸馏水、矿泉水、超纯水、纯净水等在1×105Pa下高压灭菌20 min。用灭菌后的蒸馏水配置不同浓度NaCl、葡萄糖和聚乙二醇溶液，经0.22 μm滤膜过滤除菌，滤液作为保藏水溶液，备用。用接种针将5个直径为9 mm的真姬菇菌块转入已灭菌的5 mL冻存管中，移入3 mL～4 mL保藏水溶液，浸没菌块，密封，置于4℃冰箱中保藏，设置5个重复。

1.2.2 木屑保藏

按照参考文献[13]将木屑过筛，仅保留1目～2目大小的木屑，用纯水或浸泡盐水（磷酸二氢钾0.05%，硫酸镁0.05%，pH 7.0） 进行浸泡预处理，处理好后装瓶。装瓶方法为将洗净烘干在121℃下灭菌1 h后的锥形瓶冷却后，先后装入下层（纯木屑）和上层（质量比为木屑∶麸皮∶石膏=39∶10∶1） 的保藏木屑，上下两层木屑的质量比为1∶3，装入下层木屑时需边装边摇，使木屑尽量紧实；装上层培养基时适度摇动，保证上下两层分层明显。锥形瓶装好木屑后，密封，1×105Pa下高压蒸汽灭菌2.5 h。待木屑温度降至30°C以下时，在表面接入直径为9 mm的真姬菇菌块2块，25°C下恒温培养20 d。待木屑表面长满菌丝后，置于4°C冰箱中保藏，设置5个重复。

1.2.3 斜面（对照） 保藏

制作普通PDA培养基，灭菌，摆斜面。接入一个直径9 cm的真姬菇菌块，25°C培养15 d后，置于4°C冰箱内进行保藏，设置5个重复。

1.3 保藏效果测定

1.3.1 菌丝生长速率测定

菌种分别保藏6个月和9个月后，在25°C下复苏培养3 d。取一个直径9 mm菌块，转接到PDA平板上，菌丝萌发后测量菌落直径，25°C下培养48 h后测量菌落直径，菌丝生长速率（v，cm·d-1）计算公式为：

式中：d1为菌丝萌发后菌落直径（cm）；d2为25°C下培养48 h后菌落直径（cm）。

1.3.2 菌丝脱氢酶活力测定

称取从 1.3.1 中 PDA 平板上刮取的菌丝体 0.1 g，装入15 mL离心管中，加入蒸馏水2 mL，5 mg·mL-1的MTT水溶液0.2 mL，35°C水浴避光静置3 h。用注射器抽走液体，仅留菌丝，加入DMSO 2 mL，继续35°C水浴避光静置4 h。取上清液100 μL，以DMSO作空白，在490 nm波长处，测吸光度[14]。

1.4 检测指标的差异性分析

采用软件SPSS 22.0对试验数据进行单因素方差分析（One-way ANOVA），使用Duncan检验方法，显著水平设为P＜0.05[15]，考察不同保藏方法的菌丝生长速率、脱氢酶活性之间的相关性和差异性水平。

2 结果与分析

2.1 菌丝生长速率

采用不同介质对真姬菇菌种分别保藏6个月和9个月后，测定保藏菌种的菌丝生长速率，结果见表1。

表1 不同介质保藏菌种的平均菌丝生长速率Tab.1 Average mycelium growth rate of the strains preserved in different media

从表1可以看出，真姬菇菌种在不同介质中保藏6个月和9个月时后的菌丝的生长速率是各不相同的。保藏6个月时，菌丝生长速率最快的介质是0.6%葡萄糖溶液，其次是0.1%PEG6000，第三是0.9%NaCl溶液。除了PDA斜面保藏的菌种，其菌丝生长速率较低，仅为0.25 cm·d-1以外，其余保藏介质所保藏菌种的菌丝生长速率均较高，大于等于0.625 0 cm·d-1。对比NaCl溶液、葡萄糖溶液、PEG溶液、各种水以及木屑等保藏介质对真姬菇菌种进行6个月保藏后的菌丝生长速率发现，葡萄糖溶液的保藏效果最好，其次为PEG溶液，后面依次是各种水、氯化钠溶液、保藏木屑和PDA斜面。保藏9个月时，菌丝生长速率最快的介质是矿泉水，其次是0.1%PEG10000，第三的是0.1%PEG和超纯水，与PDA斜面相对比，0.9%NaCl、1.2%NaCl、1.0%葡萄糖溶液和4种木屑介质所保藏的菌种，其菌丝生长速率较低，均低于0.35 cm·d-1，其余保藏介质所保藏菌种的菌丝生长速率均较高。同样对比NaCl溶液、葡萄糖溶液、PEG溶液、各种水和木屑等保藏介质对真姬菇菌种进行9个月保藏的菌丝生长速率发现，PEG溶液与各种水的保藏效果相当，是各介质中最好的，后面依次是葡萄糖溶液、氯化钠溶液、PDA斜面和保藏木屑。

整体对比来看，菌种保藏6个月时的菌丝生长速率明显高于保藏9个月的情况。综合对比2个时段的菌丝生长速度来看，保藏效果比较好的3种介质依次是0.1%PEG10000、0.6%葡萄糖溶液和矿泉水，而保藏效果比较差的3种介质分别是PDA斜面、杨木+水和杨木+盐水。

2.2 菌丝脱氢酶活力

采用不同介质对菌种分别保藏6个月和9个月后，测定保藏菌种的菌丝脱氢酶活力，结果见表2。

从表2可以看出，真姬菇菌种在不同介质中保藏6个月和9个月时后的菌丝脱氢酶活力是各不相同的。保藏6个月时的菌丝脱氢酶活力明显好于菌种保藏9个月的情况。保藏6个月时，菌丝脱氢酶活力最高的介质是0.1%PEG6000，其次是纯净水和矿泉水，再次是0.1%PEG20000，除杨木+水介质外，其余介质所保藏菌种的菌丝脱氢酶活力均高于PDA斜面。从介质组成来看，各种水、PEG溶液、NaCl溶液和葡萄糖溶液所保藏菌种的菌丝脱氢酶活力依次降低，但均明显好于保藏木屑和PDA斜面。保藏9个月时，菌丝脱氢酶活力最高的介质是0.1%PEG6000和0.8%葡萄糖溶液，其次是1.0%葡萄糖溶液和0.1%PEG10000，再次是纯净水。与PDA斜面相对比，0.3%NaCl溶液所保藏菌种的菌丝脱氢酶活力略低，其余保藏介质所保藏菌种的菌丝脱氢酶活力均高于PDA斜面。对比NaCl溶液、葡萄糖溶液、PEG溶液、各种水和保藏木屑等介质对真姬菇菌种进行9个月保藏后的菌丝脱氢酶活力发现，葡萄糖溶液的保藏效果最好，各种水的保藏效果略差，PEG溶液与保藏木屑的保藏效果相当，居第三，再后面依次是PDA斜面和氯化钠溶液。

表2 不同介质保藏菌种的菌丝脱氢酶活力Tab.2 Average mycelium dehydrogenase activity of the strains preserved in different media

综合对比2个时段的菌丝脱氢酶活力来看，保藏效果比较好的3种介质依次是0.1%PEG6000、1.0%葡萄糖溶液和纯净水。保藏效果比较差的3种介质依次是PDA斜面、栎木+水和杨木+水。

2.3 保藏效果的综合分析

为方便观察分析，将22种保藏介质对真姬菇菌种进行保藏6个月和9个月的菌丝生长速度和菌丝脱氢酶活力进行了汇总和对比，结果见图1。

由图1可知，综合考虑22种介质对真姬菇菌种保藏6个月和9个月的总体效果，不难看出，0.1%PEG6000溶液的总体保藏效果最好，其次是0.1%PEG10000溶液和超纯水，再次是0.8%葡萄糖溶液和矿泉水。其他介质中也有保藏效果较好的，但仅在某个时段较好，例如0.6%葡萄糖溶液在保藏9个月时菌种拥有较好的菌丝生长速度和脱氢酶活力，但保藏6个月时菌丝生长速度较高，脱氢酶活力却较低。再如用纯净水保藏6个月时真姬菇菌种拥有较好的菌丝生长速度和脱氢酶活力，但保藏9个月时菌丝脱氢酶活力较高，菌丝生长速度却较低。

2.4 保藏效果评价指标参数的差异性分析

为评价采用的2种指标参数（菌丝生长速度与脱氢酶活力）在评价保藏效果的优劣性，进一步采用Duncan检验方法对表1、表2中6个月和9个月试验数据分别进行了单因素方差分析，分别考察脱氢酶活力对菌丝生长速率的差异性水平，结果见表3。

表3 差异性分析数据表Tab.3 The data of difference analysis

如表3所示，显示保藏6个月时脱氢酶活力对菌丝生长速率的显著性结果分别为0.077；保藏9个月时脱氢酶活力对菌丝生长速率的显著性结果分别为0.624；所有结果的保藏效果均大于0.05，表明无显著差异。

3 结论与讨论

采用22种不同保藏介质对真姬菇菌种进行6个月和9个月保藏试验。结果表明，0.1%PEG6000溶液的总体保藏效果最好，其次是0.1%PEG10000溶液与超纯水，再次是0.8%葡萄糖溶液和矿泉水。0.6%葡萄糖溶液仅适于真姬菇菌种9个月保藏，纯净水仅适于真姬菇菌种6个月保藏。其他介质的保藏效果略差。不同保藏介质能够提供的环境和条件不同，也决定了不同保藏效果。本试验中选用22种保藏介质中，有的含有少量营养物质，有的则仅提供水分，但各介质保藏效果却没有表现出营养物质含量越多，效果越好的特点，这可能与不同状态菌丝对营养需求也不同有关。