CAR-T细胞技术的研发及临床应用前景

赵 琳，赵新汉

(西安交通大学第一附属医院肿瘤内科，西安 710061)

CAR-T疗法全称为chimeric antigen receptor T-cell immunotherapy，即嵌合抗原受体T细胞免疫疗法。这一概念最早由Gross等[1]于1989年提出，经过近几年连续改进并发展后得到了非常快速的进步。CAR-T细胞技术属于过继T细胞疗法的一种，但其鲜明的特点在于可使T细胞表面嵌合抗原受体，从而引导T细胞靶向杀伤肿瘤细胞。相对于传统过继细胞疗法而言，CAR-T细胞技术可以绕过抗原递呈，进入人体后能长期存活或继续繁殖。由于CAR-T细胞疗法展现出极强的技术属性和良好的复制性，并且已经在血液系统肿瘤治疗中表现出良好的临床疗效，优于现有的其他免疫细胞治疗肿瘤的疗效，吸引了越来越多的研发机构及临床中心投入其中并开展大量临床试验。本文将着重从结构和功能出发，对CAR-T细胞技术的研发与应用做出部分阐述，并对发展迅猛的CAR-T技术进行展望。

1 CAR-T的整体结构与功能

经典的嵌合型抗原受体CAR(chimeric antigen receptor，CAR)可分为5个部分，即识别肿瘤抗原的抗体单链可变区、铰链区、跨膜区、共刺激区和T细胞活化区。CAR-T细胞技术通过外源基因转染技术转染到患者的T细胞或者改造的T细胞，把识别肿瘤相关抗原(tumor-associated antigen，TAA)的单链抗体(single-chain variable fragment，scFv)和T细胞活化序列(通常为CD3ζ或FcεRIγ)的融合蛋白表达到T细胞表面。scFv通过跨膜区与T细胞胞内的活化增殖信号域偶联。这些改造的T细胞再经过体外纯化和大规模扩增后回输到患者体内，最终以非主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex，MHC)限制性模式表现强效的抗癌作用。CAR-T细胞作用过程不受MHC限制，这在一定程度上使得CAR-T细胞技术具有多靶点性，而且对表达相同抗原的肿瘤均具有识别杀伤能力。迄今，CAR-T细胞技术主要经历了4代研发历程，但有研究提出第Ⅴ代应为通用型嵌合抗原受体，具体见表1。

表1 CAR-T细胞技术比较

现有研究表明，T细胞的完全活化有赖于双信号和细胞因子的作用，例如仅含有CD3ζ序列的CAR，仍需在协同刺激信号的作用下，才能激活CAR-T细胞，这可能是第一代FRa CAR-T细胞在I期临床试验对晚期卵巢癌的抗肿瘤作用无效的主要原因[2]。为此，第二和第三代CARs在嵌合受体上加了如CD28、CD134和CD137等共刺激分子(costimulatory molecule，CM)，从而使T细胞激活，T细胞的杀伤毒性和增殖活性明显增加，并且延长了T细胞的存活时间。CD28、CD134、CD137等共刺激分子在CAR作用中究竟孰优孰劣，研究结果不尽相同[3-4]。有研究认为，CD28的刺激可使CD4 T细胞保持中心记忆性细胞状态，CD137促使CD8T中心记忆性细胞增殖[5-6]。第四代CAR-T细胞技术，包括自杀基因、整合表达免疫因子、整合共刺激因子配体等精确调控方式的加入，可能有含CD28的3个不同的共同刺激因子加入。整体上，第四代CAR-T细胞技术的研究目前更多地集中在基因修饰及免疫微环境改造层面，基因修饰(如自杀式人工调控开关的研究)方面取得了可观的成绩[7]，如，磷酸肌醇3激酶(PI3K)抑制剂的引入、MegaTAL基因编辑技术敲除TCR、PD-1敲除、CRISPR-Cas技术的引入等。免疫微环境改造是第四代CAR调控T细胞的主要研究目的之一，例如，让第四代CAR-T共表达一个白介素-12(IL-12)因子，让IL-12在靶点局部表达，改善免疫治疗微环境，激活邻近的自然杀伤(NK)细胞、浸润的T细胞等[8]，从而激活内源性抗肿瘤反应。通用CAR-T细胞技术的研究将会引入更多的基因编辑技术，最大化地突破移植物抗宿主病(GVHD)这个瓶颈，最终为CAR-T细胞技术的规模化应用奠定基础。

2 CAR-T的结构组分研究

2.1 scFV研究

嵌合型抗原受体CAR结构的第一个关键部位是膜外区上具有特异性识别并结合肿瘤细胞表面抗原的scFv，其形式为VH-Linker-VL或VL-Linker-VH。目前能获得的最小的具有特异性识别又能结合抗原的分子为scFv[9]，其大小约为28KD。scFv既可以与纳米微球结合，也可以与各种已知的靶向治疗药物结合。直到CAR开发后，scFv的独特作用才再一次引起人们的极大关注。对靶标分子及修饰性目的分子的亲和淘选是目前获得较特异的scFv片段分子的有效方式。其中，较为常用的筛选方法包括DNA文库、噬菌体文库、核糖体展示文库等筛选文库技术。靶点的选择还可应用人源化抗体和亲和力优化，主要技术为噬菌体抗体技术、嵌合抗体技术、基因工程抗体技术等。scFv亲和淘选及识别靶点既可以利用肿瘤蛋白质抗原，又可利用糖脂类非蛋白质、碳水化合物或肿瘤特异性受体的配体等。目前世界范围内多个中心研究较多的靶点为特定或某一类肿瘤相关抗原，而实体瘤的靶向选择主要包括突变的抗原或病毒抗原、组织特异性抗原、组织发育特异性抗原、过表达的抗原等[[10]。综合来看，目前常用的研究靶点有：① CD分化抗原系列：CD19(最常见)、CD20、CD22、CD30、CD33、CD107a、CD171、CDl23、CD133、CD138、CD317等；② 肿瘤标志物系列：CA125、CEA、AFP、PSMA；③ 表皮生长因子系列：Her-1、Her-2、EGFR等；④ 突变基因、酶类及其他：GD2、Mesothelin、MAGE-A3、、MUC-16、ROR-1、GPC3、DR5、TIPE3、MAGE-A3，IL-13Ra2，c-MET、CAIX等。一些改造的靶点研究在实体瘤中发展较快，如表皮生长因子受体Ⅲ型突变体(EGFRvⅢ)治疗胶质瘤患者的临床试验正在进行中；Eureka Therapeutics公司开发了专门识别HLA-A02限制的AFP抗原多肽的人源化单克隆抗体进行人源化噬菌体文库筛选[11]。随着研究的进展，一些新的肿瘤靶点也被提出，成纤维细胞激活蛋白在众多肿瘤间质中高表达，靶向该蛋白的CAR-T细胞能抑制小鼠肿瘤的生长，且无细胞毒性[12]。Tran等[13]以全基因组测序的方法，免疫靶向胆管细胞癌患者体内具有个体特征的肿瘤突变抗原靶点(erbb2基因突变)，患者病情得到控制并在观察的6个月内持续缓解。

靶点的选择及scFv的设计目前仍有很多问题亟待解决，尤其是在目前实体瘤无特异性靶点的现状下。在亲和性方面，增强CAR抗原亲和力会提高肿瘤靶向性并伴随抗原表达下调和T细胞激活增加，但高亲和力的CAR与抗原的结合过于紧密，反而导致效应T细胞结合多种目标分子受限，从而限制杀伤效力。在疗效方面，当前研究设计大都针对已知的相对较好的肿瘤相关抗原，仍缺少肿瘤特异性抗原。优化抗原筛选是靶向实体肿瘤领域的重要组成部分，但修饰后的治疗可能会导致肿瘤抗原呈递下调甚至缺失，进而导致肿瘤免疫逃逸。在靶向杀伤的进化选择上，由于实体肿瘤可能有很多靶点阴性的细胞，因此杀伤靶点阳性的细胞后，靶点阴性的细胞可能会成长。有研究指出，唤醒浸润的T细胞才能杀伤靶点阴性的肿瘤细胞。在鼠源性方面，目前的CAR大多基于鼠源抗体的scFv进行设计，这种异源模型可能会诱发宿主抗CAR反应。将scFv片段人源化或利用人源抗体设计CAR是阻止这种反应的可能策略之一。另外，特异性scFv的设计和获得，也是一个较为长期而反复的筛选过程。

2.2 载体设计研究

目前应用最多的CAR-T细胞技术仍是以病毒作为载体中介[14]，其中最为常见的仍是反转录病毒和慢病毒。两者均具有出色的基因转导效率，而慢病毒的感染效率更高，表达更持久且能传递大片段DNA序列[15]。人们对其他病毒也有研究，如Pule等[16]报道了尝试使用EB病毒转化第一代CAR-T细胞，取得了一定的疗效。溶瘤病毒(oncolytic virus，OV)作为载体的研究目前已取得了可喜的进展，这得益于溶瘤病毒能选择性感染肿瘤细胞，并在其中复制且杀伤肿瘤细胞，但不会伤及健康组织。改造的T细胞装载OV可能是一种能提高疗效的新的联合疗法[17]。就病毒载体的安全性而言，研究表明在小鼠和人T细胞中，CAR-T细胞负载低剂量病毒不会影响受体的表达和功能[18-19],但仍需更长时间观察病毒载体是否会带来有害的插入性突变。

与病毒载体相比，质粒载体的构建花费较少，而且不会整合到宿主的基因组中，安全性有一定保证。但是，质粒载体的构建需要花费更多时间，如需要一个长期的体外培养和抗性筛选过程，人类对质粒载体的抗性基因的免疫反应等限制了其临床应用研究。在物理呈递和化学诱导方面，电穿孔技术适用性较广，安全性较高，但效率较低的缺点较明显[20]。分子技术层面转染CAR-T细胞进展很快，如为体外转录编码CAR的mRNA、微环DNA等都作为转导载体进行研究，特别在第四代CAR-T细胞技术的研究中，基因工具“睡美人”(SB)转座子系统[21-22]及Piggybac转座子系统[23]的进展较快。

2.3 效应细胞设计研究

一个典型的CAR-T治疗流程包括T细胞分离、修饰、扩增、回输和监控，因此T细胞的获得、改造和培养贯穿CAR-T治疗的全过程。T细胞可来源于自体或者是健康异体，而自体来源限制了质量的规模化、需要一定的患者条件、增加了治疗的花费和时间成本。如果采用志愿者的T细胞，需要克服异体排斥反应。因此基因编辑改造在CAR-T细胞技术中被逐步开发应用。英国研究人员运用TALEN基因编辑方法，使T细胞的2个关键基因失活。一个是T细胞上原有的识别基因，它的失活使得T细胞不会攻击肿瘤细胞以外的目标，大大降低了不必要的异体免疫反应。另一个是T细胞膜蛋白基因，它的失活可以保护改造后的T细胞免遭特定药物破坏。这种被修改了免疫特性的T细胞，针对靶点CD19成功治疗了1例晚期急性淋巴白血病患儿[24]。因此，应用“基因编程”技术的异体CAR-T细胞技术可能会解决CAR-T细胞的大量生产问题。随着对T细胞的进一步认识，将会有更多的基因编辑技术应用于T细胞改造，如TALEN基因编辑技术应用于T细胞，可敲除TCR-alpha基因(降低GVHD)、CD52基因(使细胞对alemtuzumab耐药)和RQR8(自杀基因，可增加细胞对rituximab的敏感性)。已经设计成功的严格控制T细胞行为的“分子开关”的突破性成果，有望解决T细胞治疗后出现严重不良反应的问题[7,25]。

在T细胞类型及输注方式上，研究发现CD8+CAR-T细胞可以有效溶解肿瘤细胞，而CD4+CAR-T细胞会促进细胞因子大量产生，其中初始CD4+T细胞可产生大量IL-2来刺激CD8+T细胞[26]。CD4+T细胞与CD8+T细胞以1∶1的比例构成的混合细胞产物可完全根除Raji淋巴瘤[26]。对T细胞进行改造将是近年来效应细胞的发展方向之一[27]。另一个用于CAR免疫治疗来源的T细胞是γδT细胞系列。这类T细胞识别抗原不同于包括通过αβTCR识别异基因抗原的蛋白质衍生肽，因此，γδT细胞具有较低的同种异体反应性，但是显示出较好的抗肿瘤作用[28]。一般回输T细胞前，需要对患者进行预处理，主要是通过调节化疗延长过继T细胞的存在时间。基于安全性考虑，凯特琳癌症研究中心将T细胞过继调整为化疗后2天；而美国国家癌症研究所认为低剂量化疗联合CAR-T疗法对进展性B细胞淋巴瘤效果较好。目前，重组T细胞的回输方式主要是静脉回输，采用腹膜或瘤体注射的研究大部分还处在试验阶段，而采用微创介入或瘤内注射的方式可使CAR-T细胞更多地进入实体瘤内部对靶细胞进行有效杀伤，可能是未来CAR-T治疗实体瘤的方向之一。

嵌合抗原也不仅仅只是修饰T细胞，它还可以修饰细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)、NK等效应细胞[28]。Chu等[29]利用针对CS1靶点的CAR-NK细胞在多发性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)的体内外实验研究中获得了突破性疗效，而且CAR-NK细胞与CAR-T细胞治疗一样会产生IFN-γ等效应因子。NantKwest公司拥有以NK细胞治疗为核心的三大技术平台aNK、haNK和taNK。NK不表达杀伤细胞抑制性受体(killer inhibitory receptor，KIR)，进而避免其活性被靶细胞表面的MHC抑制。有研究开始探究将造血干细胞基因修饰成CAR-T的可行性，在HSCT过程中采用这种CAR-T可能尤其有利。

3 临床应用研究

CAR-T细胞技术在难治复发急性淋巴细胞白血病，慢性淋巴细胞白血病、淋巴瘤、骨髓增生异常综合征(MDS)等血液肿瘤的治疗方面已显示出良好的潜力，已成为目前唯一有希望根治恶性血液病且不依靠allo-HSCT的新型技术，也是连接移植的重要桥梁或移植后清除残存肿瘤细胞的重要武器。Porter等[30]采用CLT019治疗晚期慢性淋巴细胞白血病患者6个月的无进展生存率达67%，持续缓解时间超过10个多月，最长的完全缓解时间达到2年。一项特异性靶向CD19分子的CAR-T细胞技术能有效治疗急性B细胞性恶性肿瘤，其治疗的16例患者的完全缓解率为88%，大多数患者接受CAR-T细胞技术治疗以后可以继续HSC移植[31]。CTL019在治疗特定类型的难治性非霍奇金淋巴瘤方面已显现特有的潜力。诺华公司公布了可评估的15例弥漫性大B细胞淋巴瘤(diffuse large B cell lymphoma，DLBCL)、11例滤泡性淋巴瘤(follicular lymphoma，FL)成人患者接受CTL019治疗3个月时的II期临床研究数据。结果表明，r/rDLBCL患者组的总缓解率为47%(n=7/15)，FL患者组的总缓解率为73%(n=8/11)[32]。部分已发表的研究分析显示，骨髓有明显肿瘤浸润的恶性血液病患者更易获得缓解[30]。研究发现，l例中枢神经系统白血病(CNS-L)患者经CAR-T治疗后，脑脊液中的白血病细胞得到有效清除[33]。研究显示[34-35]，输注的CAR-T细胞可以在患者外周血和骨髓中大量存活，有效清除功能可维持6个月以上，且部分CAR-T细胞以记忆效应细胞的形式存在。CAR-T细胞有可能为治疗CNS-L、原发性CNS-L以及脑肿瘤提供新的治疗方向。

实体瘤研究也取得了部分令人欣喜的成绩。研究发现，针对间皮素(mesothelin)蛋白设计的CAR-T细胞技术治疗胰腺癌动物的平均生存期96天，较对照组平均生存期54天提高了78%[36]。间皮素也在三阴性乳腺癌和肺癌中高表达，CAR-T细胞技术在这2个领域中的应用正在探索中。在2015年美国临床肿瘤学会年会上，公布了CAR-T细胞技术首次在实体瘤胰腺癌治疗上的突破，6例受试者中有1例转移灶部分消失，4例肿瘤代谢趋于稳定或降低，并且发现相应的CAR-T细胞已经转移到患者肿瘤部位[37]。一项针对19例复发或转移的Her-2阳性肉瘤患者采用HER2-CAR T细胞治疗的I/II临床试验显示[38]，CAR-T治疗实体肉瘤后细胞存活超过6周且无明显毒性反应，患者的中位生存期达10.3个月(5.1～29.1个月)。检测的2例患者肿瘤组织中均检测到CAR-T细胞。17例可评估的患者中，4例患者有3～14个月的疾病稳定期，3例患者肿瘤切除，其中1例患者观察到肿瘤超过90%坏死的临床病理表现。

4 毒副反应及技术缺点

4.1 细胞因子释放综合征

CAR-T细胞技术在临床应用中一个最主要的不良反应是细胞因子释放综合征(cytokine release syndrome，CRS)，其主要原因是CAR-T细胞技术在短时间内清除很多癌细胞，产生大量的细胞因子，从而引起免疫反应。同时，T细胞大量增殖引起的细胞因子释放，导致机体出现发热、肌痛、低血压、呼吸衰竭等症状，严重时危及生命[39]。有研究观察到CRS与疾病进展程度或者肿瘤负荷相关，在高疾病负荷的患者体内，往往有较高的细胞因子释放。总体而言，第二代和第三代CAR较容易触动自身抗原而引起致命的CRS。严格按I期临床试验递增方案(爬坡试验)，起始剂量选择较低数量的T细胞可防止速发的、严重的毒性反应。此外，利用IL-6受体拮抗药物托珠单抗(tocilizumab)以及激素预防能够缓解该症状[31]。应注意的是，激素冲击会降低CAR-T的疗效。

4.2 靶向/脱靶毒性

CAR方法治疗相关毒性多是肿瘤相关抗原特异性T细胞“脱靶”识别了患者正常组织低表达的自身抗原所致，如B细胞血液病治疗中瞄定CD19分子引起的低丙种球蛋白血症，这也是CAR-T细胞过继后续反应的一个间接证据[31,33]。此外，治疗上仍有5%～10%的患者缺失CD19抗原，从而逃避CD19-CAR-T细胞的识别和杀伤，导致脱靶。另外，靶向Her-2的CAR-T细胞治疗可导致肿瘤部位以外的其他组织或器官遭受攻击，例如可能产生的心肺系统毒性[39]。

4.3 神经系统毒性及其他细胞毒性

CAR-T治疗白血病会引起神经系统症状，这些症状具有多样性，如谵妄、语言障碍、运动障碍、缄默症、癫痫发作、肝性脑病等[31-32]，部分症状可自行消退。也有CAR-T引起机体自身免疫性疾病风险的报道。在患儿CAR-T治疗中，部分研究观察到巨噬细胞激活综合征[39,49]。

4.4 实体瘤治疗效果较差

目前最成功的CD19-CAR-T已经在恶性血液疾病中取得了不错的效果，对于实体肿瘤的治疗效果则较差。实体瘤治疗的主要难点集中在：① 必须寻找实体瘤特异性抗原，不能侵害正常组织，这样静脉回输CAR-T细胞后，T细胞才能归巢到肿瘤位置。② CAR-T必须侵入实体瘤内部发挥作用，但即使进入肿瘤后，内环境中的浸润性的调节性T细胞(Treg细胞)、肿瘤相关巨噬细胞、程序性死亡配体PD-L1高表达、抑制性细胞因子(比如白介素10、TGFβ)，可能会抑制对其进行杀伤的各类T细胞。CAR-T细胞也会高表达程序性死亡受体PD-1。最近的临床试验在实体瘤特别是胰腺癌和肉瘤方面取得了不错的进展，再次证实CAR-T细胞能够迁移到实体肿瘤及肿瘤周围[36-38]。有研究认为改造后的T细胞还能表达次生CAR[29]，从而更有效地定位于发病部位。克服实体瘤治疗效果差的临床试验正在进行中，针对晚期以及疗效较差的实体瘤的临床试验有可能取得较好的进展。

4.5 其他

CAR-T需要对每例患者进行个体化治疗，因此存在治疗价格偏高、疗效不确定和不稳定等问题[40-41]。CAR-T临床试验各个中心的结果不一致，标准化治疗之路任重而道远。CAR-T治疗后复发也需要关注，其长期疗效和安全性有待进一步研究。

5 总结及展望

CAR-T细胞技术可能是从实验室到临床应用最快的一项技术，极大地促进了转化医学的发展。相较于化疗药物和靶向药物，CAR-T的靶向性更强，并且可以通过技术修饰达到多靶向。免疫靶向治疗的多个优点有助于治疗某些预后极差的罕见肿瘤。我们有理由相信，随着未来技术的成熟、CAR组件的进一步改进以及治疗成本的逐渐下降，CAR-T细胞技术很有可能成为医院和门诊的常规治疗方式。而且，CAR的研究并不局限于肿瘤，在目前的难治性疾病治疗瓶颈中，CAR-T细胞技术都将可能是我们攻克难治性疾病的有效武器，如抗HIV等病毒的治疗研究[42]。

CAR-T细胞技术的升级换代一直在持续研发中，每一个组件的进步都可能带来更多的临床获益。近年来快速发展的生物技术，也是CAR-T细胞技术成熟的推动力。随着未来肿瘤治疗的希望必然是构建在基于免疫疗法的联合治疗之上的观点的提出，相信将会有更多的生物技术投入到肿瘤免疫治疗的研发中。通用型CAR-T的研发将可能解决临床上的规模化应用问题，即采用正常第三方细胞来源的T细胞，通过敲除内源性TCR基因，排除同种异体TCR导致的移植物抗宿主病，且能进一步提高CAR-T的杀肿瘤效率[43-44]。产生双特异性衔接分子的CAR-T(ENG-CAR-T)细胞具有更强、更持久的抗肿瘤作用[45]。多靶标CAR-T细胞技术在临床前实验中显示出更强的抗瘤效应[46]。

干细胞技术的进步将进一步丰富CAR-T疗法。肿瘤干细胞是肿瘤复发的根本，可以预测设计针对肿瘤干细胞的靶向治疗是今后的又一重要研究方向[47]。此外，T记忆细胞的筛选将会应用更多，尤其是中央记忆性T干细胞的研究。Themeli等[48]首次利用诱导重编程干细胞(induced pluripotent stem cell，iPSC)技术获得靶向肿瘤细胞的T干细胞。该研究从正常外周血采集T细胞，通过逆转录病毒转导法导入OCT-4、SOX2、KLF4和c-MYC，使T细胞重编程为T-iPSC;再通过慢病毒载体将编码针对CD19的CAR的目的基因片段插入T-iPSC，进一步诱导分化为同时表达CDl9-CAR和内源性TCR的初始T细胞。