新诊断2型糖尿病患者血清miR-126、VEGF水平与胰岛素抵抗的相关性分析*

张跃栋，高全成，赵 睿，浦月芳，李韶华，卫俊峰

(冀中能源峰峰集团有限公司总医院：1.检验科；2.内分泌科，河北邯郸 056200)

糖尿病是内分泌科最常见的疾病，主要表现是以高血糖为特征，长期处于高血糖状态可导致各种脏器、组织受损，尤其是以肾脏、血管、心脏、眼等的慢性损伤、功能障碍为著[1-2]。随着经济水平的提高、人们生活方式的改变，2型糖尿病(T2DM)的发病率也逐年增加，多见于老年患者，如不采取有效的治疗，病情严重者容易发展为糖尿病肾病，对患者的生命健康造成威胁[3]。T2DM的发病机制尚未明确阐述，普遍认为可能与胰岛素作用缺陷有关。有研究发现，血清微小核糖核酸(miRNA)与胰岛素的生成、分泌有密切关系，且miRNA存在于人体外周血中，在血清中持续表达，且水平较稳定，有可重复性[4]，正是这一特性使miRNA可成为多种疾病的生物学标记物。血管内皮生长因子(VEGF)是一种高度特异的促血管内皮有丝分裂因子，具有增加血管内皮细胞的通透性，促进内皮细胞迁移、增殖的作用[5]。因此，本研究分析新诊断T2DM患者血清微小核糖核酸-126(miR-126)、VEGF水平与胰岛素抵抗的相关性，现将结果报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取本院2018年2月至2019年4月收治的新诊断T2DM患者86例作为观察组。其中男40例、女46例；年龄40～70岁，平均(55.82±10.63)岁；糖尿病病程2.0～11.0个月，平均病程(5.45±3.35)个月。纳入标准：(1)均符合中华医学会糖尿病学分会制定的《中国2型糖尿病防治指南(2017年版)》[6]中2型糖尿病诊断标准；(2)患者及家属同意，并签署知情同意书。排除标准：(1)存在严重沟通者；(2)伴有恶性肿瘤者；(3)有严重心、脑、肝、肾等疾病者；(4)有其他内分泌疾病史。另选取同期体检健康者86例设为对照组，其中男41例，女45例；年龄40～75岁，平均(54.76±11.63)岁。两组性别、年龄等一般资料比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。且本研究经医院伦理委员会批准同意。

1.2 方法

1.2.1 标本采集 所有受试者禁食10 h后，次日清晨取空腹肘静脉血5 mL，采用3 000 r/min分离血清，放置2支试管内备用，可放置-80 ℃低温箱中保存备用。其中1支试管内血样本用于检测血清总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、空腹血糖(FPG)、糖化血红蛋白(HbA1c)、空腹血胰岛素(FIns)水平；另1支试管血样本检测血清miR-126、VEGF水平。两组均测量身高、体质量，计算体质量指数(BMI)。

1.2.2 检测方法 (1)两组血清TC、TG水平采用酶联免疫吸附试验法(试剂盒购自上海酶联生物科技有限公司)检测，严格按照说明书进行操作；(2)两组血清FPG水平采用己糖激酶法(试剂盒购自上海酶联生物科技有限公司)检测，严格按照说明书进行操作；(3)两组血清HbA1c水平采用高效液相色谱法(伯乐，BIORADD-10，法国)检测，严格按照说明书进行操作；(4)两组血清FIns水平采用电化学发光法(罗氏，ROCHE601，德国)，严格按照说明书进行操作；(5)血清VEGF水平采用双抗体夹心酶联免疫吸附试验法(试剂盒购自上海酶联生物科技有限公司)检测，严格按照说明书进行操作；(6)miRNA-126检测方法：①免疫组化所需试剂及仪器分别为qPCR试剂盒(试剂盒购于上海宝曼生物科技有限公司)，7300荧光定量PCR仪，Trizol试剂，反转录试剂(购于美国ABI公司)，DAB显色剂，其他如氯仿、异丙醇、无水酒精、双氧水、蛋白酶、氯化钠、磷酸二氢钠、苏木素等。②血清miR-126检测方法为两组组织标本中加入Trizol 试剂1 mL，摇匀后静放4 min，加入氯仿震荡后置于冰上4 min，高速离心10 min，提取上层液，后依次加入异丙醇、无水酒精重复上述操作，当吸光度大于1.8时可用于检测。应用qPCR法检测miRNA-126水平，反转录用15 μL，反应条件为15 ℃30 min，40 ℃30 min，90 ℃10 min。均在300荧光定量PCR仪下进行，计算待测标本，以U6为内参，计算Δ循环阈值(Ct)，ΔCt=CtmiRNA-126-CtU6。

1.2.3 计算方法 (1)BMI=体质量/身高2；(2)胰岛β细胞功能指数(HOMA-β)=FIns×20/FPG-3.5；(3)胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)=FPG×FIns/22.5，HOMA-IR≥2为胰岛素抵抗；(4)胰岛素敏感指数(ISI)=1/[log(FIns)+log(FPG)]。

2 结 果

2.1 两组相关生化指标及计算结果比较 两组性别、年龄比较，差异无统计学意义(P>0.05)；两组BMI、血清TC、TG、FPG、HbA1c、FIns及HOMA-IR、HOMA-β、ISI比较，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1 两组一般资料及相关生化指标比较

2.2 两组血清VEGF、miR-126水平比较 观察组血清VEGF水平明显高于对照组，血清miR-126水平明显低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。

表2 两组血清VEGF、miR-126水平比较

2.3 血清VEGF、miR-126水平与其他指标的Pearson相关分析 Pearson相关分析发现：VEGF与BMI、TC、TG、FPG、HbA1c、FIns、HOMA-IR呈正相关，与HOMA-β、ISI呈负相关(P<0.05)；miR-126与BMI、TC、TG、FPG、HbA1c、FIns、HOMA-IR呈负相关，与HOMA-β、ISI呈正相关(P<0.05)，见表3。

2.4 影响血清VEGF、miR-126水平的多元逐步回归分析 经多因素逐步回归分析得出：影响血清VEGF表达的因素为ISI，影响血清miR-126水平表达的因素为ISI、HbA1c(P<0.05)，见表4。

表3 血清VEGF、miR-126水平与其他指标的Pearson相关分析

表4 影响血清VEGF、miR-126水平的多元逐步回归分析

3 讨 论

miRNA是一类仅仅有19～25个核苷酸的小RNA分子，可以与靶基因miRNA的3非编码区结合，又可以与编码区不完全结合，而降解RNA或转录后抑制蛋白的翻译，是一种新的基因表达方式[7-8]。有研究显示，糖尿病患者不同阶段有不同特征miRNA表达方式。且有相关资料显示，miRNA与胰岛素的生成、分泌有密切关系[9]。糖尿病患者血清miRNA差异表达发现T2DM患者血清中miRNA-126的表达缺失[10]，因此检测T2DM患者血清中miRNA-126的表达情况，有一定的临床意义。大血管并发症是T2DM患者常见的并发症之一[11]。细胞因子对血管并发症的发生、发展有重要影响，对细胞的生长、增殖具有调节作用。糖尿病是一种以高血糖为特征的一类疾病，因长时间处于高糖状态，引起许多组织缺氧、缺血，导致一些促血管生成的细胞因子表达增高，如VEGF等，在糖尿病微血管病变的发生、发展中有重要作用[12]。

本研究显示，新诊断T2DM患者血清VEGF水平明显高于体检健康者，血清miR-126水平明显低于体检健康者，说明在T2DM初期就已经开始有血管因子及基因参与。有研究显示，T2DM患者血清中低表达miR-126是T2DM患者潜在的非侵入性辅助诊断标志物及独立危险因素[13]。另有研究报道新诊断T2DM患者与HbA1c密切相关，HbA1c可作为新诊断T2DM患者肾损伤的有效评估指标之一[14]。Pearson相关分析发现：miR-126水平与BMI、TC、TG、FPG、HbA1c、FIns、HOMA-IR呈负相关，与HOMA-β、ISI呈正相关(P<0.05)，说明miR-126在糖尿病的发病过程中具有一定的作用。有研究显示血清miR-126表达偏低是T2DM肾脏疾病的危险因素，可作为治疗的靶点[15]。Pearson相关分析发现：VEGF与BMI、TC、TG、FPG、HbA1c、FIns、HOMA-IR呈正相关，与HOMA-β、ISI呈负相关(P<0.05)，说明糖脂代谢异常、胰岛素抵抗的逐步加重有一定的关系。经多因素多元逐步回归分析得出：影响血清VEGF表达的因素为ISI，影响血清miR-126水平表达的因素为ISI、HbA1c(P<0.05)，进一步说明了血清VEGF、miR-126水平与胰岛素抵抗相关指标有一定关系。有研究显示，T2DM患者的认知功能下降与VEGF水平升高有一定的相关性，说明VEGF对T2DM病情的加重有一定的影响[16]。

在正常生理条件下VEGF的表达量很低，其作用主要是维持人体正常血管生长，保持血管密度的生理稳态，但是其表达的调控受多种因素影响[17]。在T2DM患者动脉粥样硬化的形成过程中，VEGF表达水平升高，同时也参与血管腔内皮的修复，但是会引起血管的通透性增加，使炎性细胞进入血管内，导致动脉粥样硬化加重，形成恶性循环。金海英等[18]报道T2DM患者血清中VEGF水平升高，可能参与T2DM的发生、发展。李晓云等[19]报道上调miR-126的表达可有助于减轻糖尿病大鼠缺血组织损伤。何继宏等[20]报道miR-126可能通过介导内皮功能的损伤而参与糖尿病血管并发症的发生、发展。

4 结 论

高血糖、高血脂、胰岛素抵抗是引起糖脂代谢异常的因素，对血清miR-126、VEGF水平有较大的影响。新诊断T2DM患者VEGF水平升高、miR-126水平降低，二者与T2DM患者胰岛素抵抗有一定相关性。但本研究样本数较少，存在一定的局限性，需进一步深入研究。