山东部分地区新型鹅星状病毒ORF2基因克隆及遗传进化分析

姜胜男 邱杨 赵君 张慧 杨玉栋 李宝全 刘思当 李宁*

山东部分地区新型鹅星状病毒ORF2基因克隆及遗传进化分析

姜胜男①②③†邱杨④†赵君①②③张慧①②③杨玉栋①②③李宝全①②③刘思当①②③李宁①②③*

（①山东农业大学动物科技学院 山东 泰安 271000 ②山东省动物生物工程与疾病防治重点实验室 山东 泰安 ③山东省畜禽疫病防制工程技术研究中心 山东 泰安 ④山东省泰安市第二中学）

为了解新型鹅星状病毒(NGAstV)在山东部分地区的流行和变异情况，试验采用临床剖检、组织病理学观察和PCR方法对近期来自山东部分地区的32份病鹅样品进行NGAstV检测，并扩增ORF2基因进行遗传进化分析。结果表明：发病雏鹅心脏、肝脏、肾脏等组织有明显尿酸盐沉积，肾小管上皮细胞变性、坏死，脾脏部分淋巴细胞坏死，淋巴细胞数量减少。PCR检测发现被检样品中共有8份NGAstV阳性，阳性率为25%，扩增并测定其ORF2基因序列后进行遗传进化分析，显示获得的8份毒株与近年来鹅场流行的NGAstV遗传关系最近，氨基酸同源性在98.6%~99.6%之间。说明目前山东部分地区有NGAstv的流行但流行毒株尚未发生明显变异。

雏鹅通风 新型鹅星状病毒 ORF2基因 克隆 进化分析

新型鹅星状病毒(Novel Goose Astrovirus，NGAstV)是近年来在临床发病鹅中分离鉴定的一种新型禽星状病毒，患病雏鹅精神沉郁，采食下降，卧地倦动，并且伴有生长迟缓等症状，剖检病鹅可见其心脏、肝脏、脾脏等内脏表面有明显的粉末状白色或黄白色尿酸盐沉积，肾脏肿大呈苍白色，关节肿大，关节腔内有大量尿酸盐沉积[1-2]。雏鹅通常在5日龄左右开始发病，在10~15日龄为死亡高峰，至20日龄左右时，鹅群的死亡率可达20%~ 30%，给我国养鹅业造成了严重的经济损失[3]。

该病从2017年发病至今，鲜有关于其流行病学的报道，本试验对2019年1月至7月，来自山东济宁、泰安和德州等不同地区的32份临床病鹅进行了临床剖检和组织病理学诊断，并对NGAstV进行了PCR检测，结果共检测到8份NGAstV阳性样品，进一步扩增了其ORF2基因，进行遗传进化分析。本试验结果为该病的有效诊断、防控，以及病毒的流行、变异情况提供理论依据，同时为深入研究该病的致病特点奠定基础。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 TRIzol RNA抽提试剂、pMD18-T载体、T4 DNA连接酶和大肠杆菌DH-5α感受态细胞，均购自宝生物工程(大连)有限公司；ExTaq DNA聚合酶、DNA Marker、反转录试剂盒，均购自南京诺唯赞生物科技有限公司；胶回收试剂盒，购自北京康为世纪生物科技公司。其余所使用试剂均为国产分析纯试剂；10~12日龄鹅胚购自荣茂畜禽养殖有限公司。

1.2 样品采集及处理 自2019年1~7月份，对来自山东泰安、济宁和德州等地区的送检病鹅采集肝脏、肾脏等组织，加入含10×青链霉素的无菌PBS(1ml/g)，研磨后，研磨液经4℃、12000r/min离心10min，取上清液经0.22mm滤器过滤后分装，置-80℃超低温冰箱中保存，备用。

1.3 病理剖检及组织学检测 对送检的病鹅进行病理剖检，观察并记录病变。同时，采集病鹅心脏、肝脏、肺脏、肾脏、脾脏、脑等组织，4%甲醛固定，经脱水、透明、浸蜡、包埋和切片等步骤制备常规病理组织石蜡切片，切片厚度4mm，H.E.染色后，使用光学显微镜观察组织病理学变化。

表1 引物序列信息

1.4 引物设计及合成 根据GenBank已经登录的NGAstV序列的保守区设计检测引物(NGAstV-F/R)和ORF2全长引物(NGAstV-ORF2-F/R)，引物由北京六合华大基因科技有限公司合成，引物序列信息见表1。

1.5 PCR扩增 使用TRIzol方法提取病料RNA并反转录成cDNA，采用检测引物(NGAstV-F/R)进行PCR扩增，PCR扩增体系(总体积为25ml)：2×Taq Plus Master Mix Ⅱ(Dye Plus)12.5ml，上下游引物各1ml，模板3ml，ddH2O7.5ml。PCR扩增程序：95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，共32个循环；72℃再延伸7min。产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，对目的片段进行回收、纯化，送青岛擎科梓熙生物技术有限公司测序。测序结果利用SeqMan、Editseq等软件进行序列拼接分析。

1.6 ORF2扩增及遗传进化分析 使用NGAstV-ORF2-F/R引物扩增NGAstV分离株的ORF2基因全长，然后将其与GenBank中不同宿主来源的17株星状病毒序列进行比对(表2)，构建系统发育树，进行遗传进化分析。以NGAstV SDPY-1116-17(登录号MH052598.1)为参考毒株，分析本试验获取的2个NGAstV毒株ORF2氨基酸的突变情况。

表2 NGAstV参考毒株相关信息

2 结果与分析

2.1 剖检病变 对疑似感染NGAstV的雏鹅进行剖检观察，可见内脏器官表面覆盖一层白色粉末状薄膜。脏肿大，伴有红白相间的花纹，呈现典型的“花斑肾”病变。患鹅的肺脏淤血水肿，颜色暗红，表面覆盖一层灰白色粉末状尿酸盐沉积，心包表面有一层白色粉末，肝脏浆膜面覆盖部分白色粉末状物肾质，肌胃和肌肉也可见明显的尿酸盐沉着。

2.2 组织病理学观察 患病雏鹅内脏器官的组织病理学分析显示，肾脏病变最严重，表现为肾小管结构被破坏，上皮细胞变性、坏死、脱落。除此之外，脾脏部分淋巴细胞坏死，淋巴细胞数量减少，肺间质充血、出血，少量炎性细胞浸润，肝脏充血，肝细胞发生变性坏死，心肌纤维以颗粒变性为主要特点，脑未见明显病变。

2.3 PCR检测、病毒分离鉴定及遗传进化分析 采集患病鹅的肝脏、肾脏组织样品，提取RNA，使用NGAstV检测引物对样品进行PCR扩增，32份样品中共有8份可检测到489 bp的目的条带，阳性率为25%。将其回收、纯化，连接到pMD18-T载体上，挑选阳性克隆测序，序列比对发现其全部为NGAstV。进一步利用ORF2基因全长引物扩增8份阳性样品的ORF2全长，结果成功获得大小约为2290bp的目的序列，其中包含长度为2115 bp的ORF2基因全长。将其与GenBank上已有的17株AstV序列进行遗传进化分析，结果显示，本试验获得的毒株与流行毒株NGAstV-CXZ18、NGA stV-SDPY-1116-17、NGAstV-SD01和NGAstV-GD的亲缘关系最近(附图)。选取2019WS-576和2019XT-583毒株的ORF2编码氨基酸与参考毒株SDPY-1116-17进行同源性分析，结果发现其同源性高达99.4%~99.6%，2019XT-583与SDPY-1116-17有4个氨基酸位点差异，分别是第229位由Q突变为P，456位E变为D，540位L变为Q，以及第695位T突变为A，2019WS-576与SDPY-1116-17仅有3个突变氨基酸位点。

3 讨论与结论

（1）禽星状病毒可分为3种，分别是禽星状病毒1型、2型和3型。禽星状病毒1型包括火鸡星状病毒1型，禽星状病毒2型包括禽肾炎病毒1型和禽肾炎病毒2型，禽星状病毒3型有鸭星状病毒和火鸡星状病毒2型[4]。不同宿主感染禽星状病毒出现的临床症状有较大差异，例如禽肾炎病毒引起鸡腹泻性肠炎和肾炎[5]；鸭星状病毒感染雏鸭，导致病毒性肝炎[6]。（2）近年来，我国山东、江苏、安徽和福建等地鹅场相继发生以雏鹅内脏、关节大量尿酸盐沉积为主要特征的痛风性疾病。该病发病率和死亡率高，给养鹅业造成了较大经济损失。目前已有学者对雏鹅痛风进行了一系列的临床诊断和分析，夏伟斌等[7]认为雏鹅痛风的主要原因为长时间摄入高蛋白质饲料，导致肾功能下降，而且从营养、环境等方面对痛风雏鹅进行治疗后，效果较为明显，但这不能排除病毒感染的可能。近期，姜晓宁等[1]对来自山东、安徽、江苏等地的143份病鹅样品进行检测，发现星状病毒的检出率高达96.5%，并分离鉴定了鹅源星状病毒SDPY株，以病毒ORF1b进行遗传进化分析发现，SDPY株单独处于一个小的进化分支，与其他鸡源、火鸡源、鸭源及鹅源星状病毒代表株同源性均较低，核苷酸同源性为49.5%~67.7%，氨基酸同源性为44.4%~72.6%，表明引起当前雏鹅痛风的星状病毒为NGAstV。此外，也有多项研究表明NGAstV是鹅内脏痛风的主要病原[3, 8]。在本试验中，从32分临床样品中检测到8份NGAstV，阳性率为25%，剖检NGAstV感染鹅可见心包和肝脏表面覆盖有一层白色粉末状薄膜，肾脏肿大，有明显的尿酸盐沉积。组织病理学观察发现患病雏鹅的病变主要集中在肾脏，表现为肾小管上皮细胞严重脱落、坏死，而心脏、肝脏和脾脏等组织仅表现轻度的细胞变性、坏死，未见其他特征病变。据此推测出现此现象的原因在于NGAstV对肾脏有较强的组织嗜性，感染后导致肾组织结构破坏，功能受损，进而引起动物出现代谢障碍，尿酸盐大量蓄积。临床上，应该根据该病剖检的特征病变和PCR病原学进行综合诊断。（3）星状病毒的ORF2基因编码由704个氨基酸残基组成的衣壳蛋白，是星状病毒的主要结构蛋白，在病毒入侵宿主细胞、病毒粒子组装等过程发挥重要作用，同时衣壳蛋白可与宿主抗体、补体发生相互作用，调控宿主的免疫反应[9]。在本试验中，我们扩增了8份阳性样品的ORF2基因并构建遗传进化树，发现其与目前鹅场流行的NGAstV毒株的遗传关系最近，氨基酸同源性在97.6%~99.3%之间。衣壳蛋白的N端富含碱性氨基酸，保守性较高，C端为高变区，编码的蛋白能够在病毒粒子表面形成纤突结构，是病毒主要的抗原决定蛋白，同时还能参与病毒与宿主细胞膜融合，对病毒的感染和致病性有重要影响[10]。近期有研究者将NGAstV毒株连续传代，然后选取30，50，60，70代次病毒进行全基因组序列测定，发现病毒编码区在传代过程中共产生了8个氨基酸位点突变，其中有6个突变位于衣壳蛋白，分别是第26，284，489，610，650，660位，更重要的是，第489，610位氨基酸突变可能导致其编码蛋白的构象发生改变，降低病毒对雏鹅的致病力[11]。以NGASsV-SDPY-1116-17为参考毒株，选取本试验获得的两个毒株与之进行氨基酸同源性分析，发现毒株2019WS-576有3个氨基酸位点差异，分别为第229，456，540位，而2019XT-583除上述三个突变位点外，还包括第695位，虽然没有与上述传代毒株相同的突变位点，但是发现本研究中的突变位点主要集中在衣壳蛋白的纤突结构，考虑到纤突蛋白在病毒致病过程中的重要作用，这些突变氨基酸能否影响蛋白构象、功能，进而影响病毒毒力还需进一步验证。但是整体上，以上结果表明目前山东部分地区流行的NGAstV尚未发生明显遗传变异。（4）目前，关于新型鹅星状病毒的研究较少，其主要传播途径、致病机制等尚不明确，因此加强对该病的流行病学调查和分子变异分析有助于该病的有效防控，还能为深入研究该病的致病特点奠定基础。

注：Δ为试验获得的NGAstV毒株ORF2序列。

附图 临床NGAstV毒株的ORF2遗传进化分析

[1] 姜晓宁, 田家军, 杨晶等. 导致雏鹅痛风新型鹅星状病毒的分离鉴定[J]. 中国兽医学报, 2018, 38(5): 871-877.

[2] Zhang X Y, Ren D, LI T F, et al. An emerging novel goose astrovirusassociated with gosling gout disease, China [J]. Emerg MicrobesInfect, 2018, 7(1): 1-8.

[3] Zhang Q, CAO Y, Wang J, et al. Isolation and characterization of an astrovirus causing fatalvisceral gout in domestic goslings[J]. Emerg Microbes Infect, 2018, 7(1): 1-11.

[4] 王晓冰, 施建鑫, 罗开健. 禽星状病毒感染的流行特点[J]. 养禽与禽病防治, 2018(10):2-7.

[5] Nnrita M, Umiji S, Fueuat K, et al. Pathogenicity of Aviannephritis virus in chicks previously infected withinfectious bursal disease virus [J]. Avian Pathol, 1991, 20(1): 101-111.

[6] 刘吉山, 李娇, 祖立闯等. 一株鸭星状病毒的分离鉴定[J]. 动物医学进展, 2016, 37(3): 38-41.

[7] 夏伟斌. 鹅痛风病的病因分析与防治措施[J]. 中国畜牧兽医文摘, 2018, 34(04): 176.

[8] 邵骜骏, 李阁, 张思旺等. 一例鹅痛风病的诊断[J]. 黑龙江畜牧兽医, 2019(06): 86-87, 171.

[9] Arias Cf, Dubois RM. The astrovirus capsid: areview [J].Viruses, 2017, 9(1): 15.

[10] Dong J, Dong L, Mendez E, et al. Crystal structure of the human astrovirus capsid spike[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2011, 108(31): 12681-12686.

[11] 张清水. 新发肾致病型鹅星状病毒的分离鉴定及弱毒株选育[D]. 中国农业大学: 北京, 2018.

“十三五”国家重点研发计划(2016YFD0500100)；中国博士后科学基金面上资助(2019M652450)；山东省“双一流”奖补资金项目(无编号)

†共同第一作者

（2020–05–01）

S835.2

A

1007-1733(2020)07-0011-04