汉黄芩素对2型糖尿病小鼠糖尿病视网膜病变的影响

颜 彦，吴 琳，郑海龙

(1.海南医学院第一附属医院药学部，海南 海口 570100；2.海南医学院热检学院，海南 海口 570102；3.海南医学院第一附属医院内分泌科，海南 海口 570100)

随着我国经济的飞速发展，人们的高节奏生活及饮食结构的改变，现在我国已经赶超美国成为第一大糖尿病大国[1]。2型糖尿病发展至后期会出现严重的并发症，如糖尿病肾病、糖尿病视网膜病变、糖尿病足等[2-3]。有文献报道[4-5]，汉黄芩素在人结肠癌细胞中可通过p53诱导癌细胞凋亡，且能够显著抑制肿瘤的生长并促进树突状细胞、T细胞等在肿瘤组织中的聚集，证实了汉黄芩素的抗肿瘤作用及免疫增强活性。然而，目前汉黄芩素对于2型糖尿病视网膜病变的相关研究较少。目前，已有多数研究[6-8]证实血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)和转化生长因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)与糖尿病视网膜病变关系密切。本研究从汉黄芩素改善糖尿病人视网膜病变的角度出发，研究其对KK/Upj-Ay小鼠2型糖尿病及糖尿病视网膜病变的改善作用及作用机制，为汉黄芩素治疗糖尿病视网膜病变提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

KK/Upj-Ay小鼠(自发性2型糖尿病小鼠)，63只，5周龄；昆明小鼠21只，体质量30～40 g，SPF级，雄性，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，动物生产许可证号：SCXK(湘)2011-0003。自购买之日起，适应性饲养1周，期间自由摄食与饮水，适应期内所有小鼠的饲料与饮用水一致。汉黄芩素(生产批号：MUST-11040321纯度>98%)，购于成都曼斯特有限公司；链脲佐菌素(STZ，美国Sigma公司，批号：S0130-1g)；盐酸二甲双胍片(中美上海施贵宝制药有限公司，批号：AAH5579，规格：0.5 g/片)。柠檬酸(天津市北辰方正试剂厂，批号：20170225)；总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白(HDL-C)、低密度脂蛋白(LDL-C)、三酰甘油(TG)试剂盒、空腹胰岛素(fasting insulin,FINS)ELISA试剂盒(南京建成生物工程研究所)；VEGF、bFGF、TGF-β试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)；BGMS-1血糖仪(长沙三诺生物传感技术股份有限公司)；专用饲料(北京博爱港商贸中心)；M200PRO型多功能酶标仪为瑞士TECAN公司产品；引物序列由上海生工生物工程公司合成(见表1)。

表1 各引物序列

1.2 动物分组及给药[9]

KK/Upj-Ay小鼠，5周龄，按照空腹血糖(FBG)水平随机分组，分别为模型组、汉黄芩素组(6.32 g生药/kg)、二甲双胍组(0.1 g/kg)；以正常昆明小鼠为对照组，每组21只。采用灌胃给药，对照组和模型组给予等体积的蒸馏水，1次/天，连续给药3个月。

1.3 糖尿病视网膜病变(DR)模型的建立[10-12]

KK/Upj-Ay小鼠连续饲喂专用饲料3个月，每1个月进行一次眼底检查，糖尿病小鼠出现视网膜出血或新生血管即糖尿病视网膜病变小鼠模型成功。对照组小鼠给予正常饲料饲喂。

1.4 ELISA法

连续给药3个月后，采用酶联免疫法(ELISA)四组小鼠在处死前，尾静脉采血，按照试剂盒说明，测定血清中TC、TG、HDL-C、LDL-C含量，及血清FINS水平。

1.5 小鼠视网膜VEGF免疫荧光

给药3个月结束采完血后，随机取7只小鼠麻醉处死，摘取眼球，固定于10%多聚甲醛液中固定，切片，加入抗VEGF的一抗抗体，室温孵育1 h，PBS洗三遍，每次5 min。加入二抗，室温孵育30 min。PBS洗三遍，每次5 min。加入DAPI原液染色5 min，用PBS洗三遍，洗去多余的DAPI，加入20 μL抗荧光淬灭封片剂封片。

1.6 Western blot法

随机取7只小鼠，剥离小鼠视网膜，加入RIPA裂解液冰上裂解30 min，充分裂解后，低温离心机4 ℃ 12 000 rpm离心10 min，采用BCA试剂盒进行蛋白定量。将不同浓度的蛋白样品用PBS稀释成相同浓度，并加入5×上样缓冲液，使用10%～12%的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离，脱脂奶粉封闭PVDF膜1h，4℃条件下孵育一抗过夜。二抗室温孵育含蛋白的PVDF膜2h，TPBS洗涤膜3次。采用ECL显色法，在暗室采用胶片曝光，用Image J软件分析。

1.7 实时荧光定量PCR(qRT-PCR)

剩余7只小鼠取视网膜组织，常规方法提取RNA，TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit进行反转录：涡旋震荡混匀，短暂离心，使管壁上的残留集中到管底。设定PCR程序，42 ℃孵育40 min，85 ℃，5 min。反应结束后，冷却，cDNA产物置于-20 ℃暂存。采用TaqMan Small RNA Assays进行扩增，用DEPC水补齐至10 μL，加入八联排管中。混匀，离心，放入PCR仪中，选择两步法程序，反应结束后采用相对定量方法进行mRNA水平分析，采用2-ΔΔCt法计算相对表达量。△△Ct计算公式：△△Ct=(Ct目的基因-Ct内参基因)实验组-(Ct目的基因-Ct内参基因)对照组。

1.8 统计学分析

应用SPSS 21.0软件进行统计学分析，计量资料数据以均值±标准差表示，多组间均数的比较采用单因素(one-way ANOVA)方差分析，组间两两比较采用S-N-K检验。当P<0.05时，表示差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 血清中TC、TG、HDL-C、LDL-C和FINS含量

如表1所示，四组小鼠HDL-C、TC、LDL-C、TG和FINS的含量差异具有统计学意义(P<0.05)。与对照组比较，模型组TC、TG、LDL-C、FINS含量显著升高，汉黄芩素或二甲双胍能显著降低TC、TG、LDL-C、FINS含量，升高HDL-C含量。

表1 各组小鼠血清中TC、TG、HDL-C、LDL-C、FINS含量比较

2.2 VEGF在小鼠视网膜的分布及表达

通过采用免疫荧光法检测VEGF在小鼠视网膜的分布及表达情况，结果发现，与对照组比较，模型组视网膜神经节细胞层VEGF呈现高表达(箭头部分，红色荧光)，荧长较强。汉黄芩素组和二甲双胍组相对于模型组荧光明显的减弱，说明汉黄芩素对小鼠视网膜VEGF的表达有明显的抑制作用(图1)。

图1 各组小鼠荧光染色结果(IF，400×)A：对照组、B：模型组、C：汉黄芩素组、D：二甲双胍组

2.3 VEGF、bFGF、TGF-β蛋白表达

采用Western blot法检测了各组小鼠视网膜VEGF、bFGF、TGF-β蛋白表达情况，结果表明，四组小鼠视网膜VEGF、bFGF、TGF-β蛋白表达比较，差异具有统计学意义(P<0.05)。与对照组比较，模型组VEGF、bFGF、TGF-β蛋白表达显著增加(P<0.05)。与模型组相比，汉黄芩素组和二甲双胍组VEGF、bFGF、TGF-β蛋白表达显著降低(P<0.05)。Western blot结果见图2，各蛋白的相对密度见表2。

图2 各组小鼠相关蛋白表达A：对照组，B：模型组，C：汉黄芩素组，D：二甲双胍组

表2 各组小鼠视网膜中VEGF、bFGF、TGF-β蛋白含量比较

2.4 VEGF、bFGF、TGF-β的mRNA水平

采用qRT-PCR对小鼠视网膜VEGF、bFGF、TGF-β的mRNA水平变化情况进行了检测，结果发现，四组视网膜VEGF、bFGF、TGF-β mRNA水平比较，差异具有统计学意义(P<0.05)。与对照组比较，模型组VEGF、bFGF、TGF-βmRNA表达显著增加(P<0.05)。与模型组相比，汉黄芩素组和二甲双胍组VEGF、bFGF、TGF-β mRNA表达显著降低(见表3)。

表3 各组小鼠视网膜中VEGF、bFGF、TGF-β mRNA含量比较

3 讨 论

糖尿病确切的病因和发病机制尚未完全阐明，对糖尿病的治疗已成为需要全人类共同攻克的难题[13]。2型糖尿病到后期会产生严重的并发症。常见的并发症包括糖尿病视网膜病变、糖尿病肾病、糖尿病足等[14]，建立2型糖尿病视网膜病变小鼠模型是研究糖尿病的理想工具，一个长期、稳定的2型糖尿病视网膜病变小鼠模型，对于进一步研究糖尿病视网膜病变很有必要[15]。本研究采用KK/Upj-Ay小鼠诱发2型糖尿病视网膜病变模型比较稳定、成模率更高。

汉黄芩素是黄芩中的成分，属于黄酮类化合物，具有抗病毒、抗菌、抗炎、解热等作用。研究还证实汉黄芩素有降血糖、抗氧化作用[16]。从实验结果可以看出，汉黄芩素可显著增加HDL-C的含量，同时降低TC、TG、LDL-C的含量，说明汉黄芩素对小鼠2型糖尿病诱发的高脂血症具有明显的治疗作用。VEGF、TGF-β、bFGF是眼睛新生血管的形成、血管增生和炎症形成的主要作用因子。相关实验表明，VEGF可以促进血管内皮细胞的增殖，形成新生毛细血管。TGF-β可以诱导巨噬和中性粒细胞进行抗炎反应。bFGF则主要和胶原纤维的合成有关。2型糖尿病视网膜病变到后期有大量的炎性细胞浸润，还会生成大量的新生血管,推测汉黄芩素发挥改善视网膜病变的效应，与VEGF、bFGF、TGF-β等相关。免疫荧光显示，汉黄芩素能明显抑制小鼠视网膜VEGF的表达。实验结果显示，汉黄芩素对小鼠视网膜病变的VEGF、bFGF、TGF-β蛋白和mRNA表达有下调作用。综上所述，汉黄芩素对小鼠2型糖尿病视网膜病变的保护作用可能是通过抑制VEGF、bFGF、TGF-β表达起作用。