α-亚麻酸对戊酸雌二醇诱导的多囊卵巢综合征大鼠的影响

吴美丽，王德莹，刘 国

(1.青岛市妇女儿童医院妇科，山东 青岛 266011；2.哈尔滨医科大学附属第二医院妇产科，黑龙江 哈尔滨 150080；3.滨州医学院附属医院妇科，山东 滨州 256603)

多囊卵巢综合征(polycystic ovary syndrome, PCOS)属于异质性生殖功能障碍，其常与脂糖代谢异常疾病并存，发病率约占育龄期妇女的5%～10%[1]。雌激素通过作用于下丘脑和垂体，正反馈调控LH的分泌，使LH含量呈现持续高水平，无法形成月经中期的LH峰，抑制排卵[2-3]。

α-亚麻酸(Alpha-Linolenic acid, ALA)主要存在于亚麻籽和苏子中。研究结果表明[4]，ALA可通过降低氧化应激水平促进卵母细胞体外成熟，提高胚胎发育潜能。雄激素分泌增多是造成PCOS生殖紊乱的主要原因之一[5]。相关研究表明[6]，CYP11A1编码的胆固醇侧链裂解酶是催化雄、雌激素合成的关键限速酶。本研究，通过建立戊酸雌二醇诱导的SD大鼠多囊卵巢综合征模型，探讨ALA对PCOS大鼠性激素水平及卵巢组织形态的影响及作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物

6周龄雌性SD大鼠，SPF级，180～220 g，32只，由上海斯莱克实验动物有限公司提供[实验动物许可证号SCXK(沪)2018-0005]。对动物的处置符合《关于善待实验动物的指导性意见》。

1.2 药品与试剂

戊酸雌二醇(德国拜耳，国药准字J20171038)；ALA(成都德锐可生物科技有限公司)；苏木素-伊红染色试剂盒(北京索莱宝科技有限公司)；雌二醇(E2)、孕酮(P)、睾酮(T)和脱氢表雄酮(DHEA)酶联免疫(ELISA)检测试剂盒(上海酶联生物科技有限公司)；GAPDH和CYP11A1基因引物序列由上海生物工程有限公司合成(表1)。

表1 各引物序列

1.3 仪器

电子分析天平(上海光学仪器厂)；酶标仪(Thermo Scientific MultiSkan Go)；光学显微镜(日本Olympus)；PCR仪(苏州东胜兴业科学仪器有限公司)。

1.4 大鼠多囊卵巢综合征模型的建立及分组

随机选取24只SD大鼠肌肉注射4 mg戊酸雌二醇(溶于0.2 mL油剂中)，连续注射7周建立PCOS模型[3]。从第50天开始，将造模成功的大鼠随机分为三组：模型组(灌胃生理盐水)、ALA 50 mg/kg组和ALA 200 mg/kg组(分别连续灌胃50 mg/kg和200 mg/kg ALA 30天)，另选正常雌性大鼠作为对照组(灌胃生理盐水)，每组8只。

1.5 观察指标及检测方法

1.5.1 卵巢组织称重 在末次给药12 h后，大鼠经腹腔注射3%戊巴比妥钠，采血后，迅速剖腹摘取左右两侧卵巢组织，在电子分析天平上进行称重并记录。

1.5.2 卵巢组织形态学观察 将各组大鼠左侧卵巢组织放入4%多聚甲醛中固定24 h后，进行脱水，透明，石蜡包埋，切片(厚度：5 μm)。然后将切片放入60 ℃烘箱中烤3 h，脱蜡水化，水洗1 min，苏木素染色10 min，水洗1 min，伊红着色1 min，脱水后中性树脂封片，光镜下观察卵巢组织形态。

1.5.3 成熟卵泡及黄体数量统计 每组观察统计8个卵巢，每个卵巢观察统计5张HE染色的切片中成熟卵泡及黄体数量。

1.5.4 血清中性激素含量测定 各组大鼠经麻醉后，腹主动脉取血，2 000 r/min离心15 min，将上层血清转入Eppendorf管中，-70 ℃保存备用。采用酶联免疫(ELISA)法测定血清中雌二醇(E2)、孕酮(P)、睾酮(T)和脱氢表雄酮(DHEA)的含量，严格按照试剂盒说明书进行操作。

1.5.5 荧光定量PCR检测相关基因的mRNA表达 采用Trizol试剂法提取各组大鼠卵巢组织中的总RNA，随后采用相关试剂盒对样品RNA进行逆转录，进一步对cDNA进行扩增。扩增条件是：95 ℃预变性4 min，95 ℃变性15 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸30 s，共计30个循环反应。采用2-ΔΔCT法计算相对表达量。△△Ct计算公式：△△Ct=(Ct目的基因-Ct内参基因)实验组-(Ct目的基因-Ct内参基因)对照组。

1.6 统计学分析

应用SPSS 21.0软件进行统计学分析，计量资料均服从正态分布，结果以均数±标准差表示，多组间均数的比较采用单因素(one-way ANOVA)方差分析，组间两两比较采用SNK检验。当P<0.05时，表示差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 卵巢组织称重结果

由表2可见，与对照组比较，模型组左、右两侧卵巢组织质量均显著增加。与模型组比较，ALA处理组大鼠左、右两侧卵巢组织质量均显著降低，且ALA 200 mg/kg组大鼠两侧卵巢组织质量均显著低于ALA 50 mg/kg组。

表2 各组大鼠左、右两侧卵巢组织质量

2.2 卵巢组织形态学观察及分析结果

由图1可见，对照组大鼠卵巢组织可见不同发育程度的卵泡、黄体，颗粒细胞形态良好，排列整齐，未见细胞坏死。模型组大鼠卵巢组织可见囊性卵泡显著增多，颗粒细胞呈现扁平或立方状，黄体及不同发育阶段的卵泡减少。与模型组大鼠卵巢组织相比，ALA组黄体及不同发育阶段的卵泡数量明显增多，颗粒细胞形态明显改善，囊性卵泡明显减少。50 mg/kg和200 mg/kg ALA两组卵巢组织形态改善差异不明显。

图1 各组大鼠卵巢组织卵泡、黄体，颗粒细胞形态(HE,400×)A:对照组；B模型组;C:50 mg/kg ALA;D:200 mg/kg ALA

2.3 成熟卵泡及黄体数量统计结果

由表3可见，与对照组比较，模型组组大鼠卵巢组织中成熟卵泡及黄体数量均减少，差异均有统计学意义(P<0.05)。与模型组相比，ALA处理组大鼠卵巢组织中成熟卵泡及黄体数量均增多，并呈剂量依赖效应。

表3 各组大鼠成熟卵泡及黄体数量 (个)

2.4 大鼠血清中E2、P、T、DHEA含量

如表4所示，与对照组比较，模型大鼠血清中E2、T的含量显著升高，而P含量显著降低，给予ALA干预后，大鼠血清中E2、T含量显著降低，而P显著升高，DHEA在各组中无显著变化。

表4 各组大鼠血清中E2、P、T、DHEA的含量比较

2.5 大鼠卵巢组织CYP11A1 mRNA表达

统计结果表明，与对照组相比，模型组大鼠卵巢组织中CYP11A1 mRNA表达增加，差异具有统计学意义(P<0.05)；与模型组相比，ALA 200 mg/kg组大鼠卵巢组织中CYP11A1 mRNA表达下降，差异具有统计学意义(P<0.05，见图2)。

图2 各组大鼠卵巢组织CYP11A1 mRNA检测结果A：对照组；B：模型组；C组：ALA 50 mg/kg；D:ALA 200 mg/kg与对照组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05；与ALA 50 mg/kg比较，+P<0.05

3 讨 论

本研究采用肌肉注射戊酸雌二醇建立大鼠PCOS模型，血清中性激素含量测定结果显示，模型组大鼠血清中睾酮含量较正常组显著升高,卵巢组织可见囊性卵泡显著增多，颗粒细胞呈现扁平或立方状，黄体及不同发育阶段的卵泡减少，成熟卵泡数量减少。上述结果表明，本研究成功建立戊酸雌二醇诱导的多囊卵巢综合征大鼠模型。

ALA属于ω-3脂肪酸，在人体内可直接分解为DHA和EPA[7]。ω-3脂肪酸在增加胰岛素敏感性、降低高胰岛素血症患者血清中胰岛素含量、降低血浆中甘油三酯、减少肝脏脂肪、抑制炎症及肥胖症方面，表现出良好的作用[8-10]。Shahnazi等人的研究，发现ω-3脂肪酸对PCOS患者的生殖系统有积极作用[11]，其中，EPA能够通过调控卵巢颗粒细胞中IGF-1和COX-2的表达，从而改善PCOS患者的生殖障碍。ALA因其广泛存在于陆地植物中，如亚麻籽，与EPA相比，原料价格低廉、资源丰富[12]。

本研究发现，ALA能使PCOS大鼠卵巢组织形态及成熟卵泡和黄体数量明显增多，颗粒细胞形态明显改善，囊性卵泡明显减少；血清中雌二醇、睾酮含量减少，孕酮含量增多，并有剂量依赖效应，说明ALA能明显改善卵巢机能。CYP11A1编码的胆固醇侧链裂解酶是催化雄、雌激素合成的关键限速酶[6]，本研究提示，ALA可通过下调PCOS大鼠卵巢组织中CYP11A1基因的转录，进而抑制胆固醇侧链裂解酶的活化，从而使PCOS大鼠血清中睾酮含量降低。

综上所述，ALA可明显改善戊酸雌二醇诱导的多囊卵巢综合征大鼠卵巢组织形态及增加卵巢组织质量和功能。