真武汤对心肾阳虚型心力衰竭大鼠心肌细胞保护的自噬机制研究

黄 剑马晓彤张亚杰李丽静韩 冬刘 佳

(长春中医药大学药学院,长春 130117)

心力衰竭又叫充血性心力衰竭(congestive heart failure,CHF),现代医学研究表明,CHF 是心脏无法满足机体代谢所需要的血量进而引起的以循环功能障碍为主要表现的临床综合征,包含身体多个方面改变,最终出现心功能失代偿,出现心力衰竭的症状[1]。 CHF 属于中医证候中的心肾阳虚证,其具有本虚标实的特点,表现为脾气虚、肺气虚、肾气虚和肝气虚,以水停血瘀、阳虚水泛为发病机制,以上表现属《伤寒论》中的真武汤证,应以真武汤加以治疗。 临床研究表明真武汤可以辅助西药进行慢性心力衰竭治疗,可以辅助西药逆转心肌重构,提高心脏供血能力,改善心力衰竭患者心功能[2-3]。 因此,本实验依据真武汤对心肌的保护作用,通过注射阿霉素建立心肾阳虚型心力衰竭大鼠模型,研究大鼠接受真武汤前后对心肾阳虚型心力衰竭大鼠行为体征、血流动力学以及相关自噬过程中蛋白表达水平的影响。

1 材料和方法

1.1 实验动物

健康2 月龄SPF 级SD 雄性大鼠70 只,体重260～280 g 购自辽宁省长生生物技术有限公司[SCXK(辽)-2016-0001]。 甲状腺切除手术于长春中医药大学药学院中药药理实验室[SYXK(吉)2016-0017]进行。 动物实验及操作流程严格遵守3R 原则,动物实验经长春中医药大学伦理委员会审查批准(20190051)。 动物饲养于清洁级动物室,室温为25℃,相对湿度为50%～70%,饲喂大鼠维持饲料,自由饮水。

1.2 主要试剂与仪器

注射用盐酸多柔比星(161108),购置于山西普德药业股份有限公司；芪苈强心胶囊(20160412),购置于石家庄以岭药业股份有限公司；大鼠BNP、LA、CaN、TSH、T3、T4 试剂盒购置于上海源叶生物科技有限公司；全蛋白提取试剂盒、BCA 蛋白浓度测定试剂盒、一抗二抗去除液、SDS-PAGE 凝胶快速制备试剂盒、Western 洗涤液、SDS-PAGE 电泳液(干粉)、 ECL 发 光 液 购 置 于 中 国 wanleibio；LC3( WL01506 )、 BECLIN 1 ( WL02508 )、 P62(WL02385)、ATG5(WL02411)、羊抗兔IgG-HRP(WLA023)、内参抗体β-actin(WL01372)购置于中国wanleibio；辣根酶标记链酶亲合素购置于中国碧云天生物技术有限公司；山羊血清、DAB 显色液购置于中国Solarbio。

电子天平(上海精密科学仪器有限公司)；台式低温高速离心机(上海飞鸽仪器厂)；酶标仪(伯乐生命医学产品(上海)有限公司)；水平摇床(北京六一)；电泳装置(北京六一)；凝胶成像系统(北京六一)；石蜡切片机(德国Leica 公司)；显微镜(日本OLUMPUS 公司)；16 道生理记录仪(美国Biopac 公司)。

1.3 实验方法

1.3.1 建模及分组

腹腔注射3%的戊巴比妥钠溶液(1 mL/kg)麻醉大鼠,BL-420F 生物信号采集分析系统记录胸前导联或II 导联心电图[4],筛选并弃去ST 段有异常变化者和心律失常者。 本实验动物模型的建立,参考中医证候心肾阳虚证以及吴向东[5]用大鼠建立的该种证候动物模型并改进。 取符合要求的健康SPF 级的雄性SD 大鼠70 只,随机分为正常组(Control,10 只)、模型组(CHF,60 只)。 大鼠腹腔注射3%戊巴比妥钠溶液(1 mL/kg),麻醉后摘除双侧甲状腺。 空白对照组行假手术。 术后第15 天起,模型组大鼠尾静脉注射盐酸阿霉素(4 mg/kg),空白对照组注射等剂量生理溶液,每周注射1 次,持续5 周。 术后第35 天将存活下来模型组动物再次随机分为5 组,即模型对照组(CHF)、芪苈强心胶囊组(QL,0.37 g/kg)、真武汤高剂量组(ZWG,1.35 g/kg)、真武汤中剂量组(ZWZ,0.81 g/kg)、真武汤低剂量组(ZWD,0.41 g/kg)各12 只。 次日灌胃相应药物,空白对照组和模型对照组灌胃蒸馏水,连续10 d。

1.3.2 真武汤对心肾阳虚型CHF 大鼠一般情况影响

给药后每周测定大鼠体温、体重,详细记录进食数量和饮水情况。

1.3.3 真武汤对心肾阳虚型CHF 大鼠心脏指数的影响

称取大鼠体重,处死后,迅速取出心脏组织,以生理盐水清洗,称取心脏重量,公式如下:CWI=大鼠心脏重量/大鼠体重×100%。

1.3.4 真武汤对心肾阳虚型CHF 大鼠血流动力学影响

第10 天给药完毕30 min 后,打开已定标好的十六道生理记录仪及软件后,以20%乌拉坦0.5 mL/100 g 腹腔注射麻醉大鼠,通过十六导系统,观察并记录各组左室最大上升速率(+dp/dtmax)、左室最大下降速率(-dp/dtmax)等指标的变化情况。

1.3.5 真武汤对心肾阳虚型CHF 大鼠血清T3、T4和TSH 含量影响

大鼠以3%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉,平均麻醉剂量为30 mg/kg,等待大鼠被麻醉后,用手术剪切开动物的腹腔,迅速地剪断股动脉,进行采血,最后分离血清,使用大鼠T3、T4、TSH 的ELISA 试剂盒(上海源叶生物科技有限公司)测定大鼠血清中T3、T4、TSH 含量[6]。

1.3.6 真武汤对心肾阳虚型CHF 大鼠心肌细胞BNP、LA 和CaN 含量影响

取心肌组织,加入适量的蛋白萃取剂,心肌组织标本匀浆化。 300 r/min,离心20 min。 收集上清。 同上述检测方法类似,经过稀释、加样、温育、洗涤等步骤,通过标准曲线回归分析计算浓度。

1.3.7 真武汤对心肾阳虚型CHF 大鼠心肌LC3、ATG5、P62 蛋白表达影响

称取心肌组织,通过全蛋白提取试剂盒(中国wanleibio) 进行组织匀浆,低温离心(4℃,12000 r/min,10 min)分离上清得到蛋白质抽提物。 通过BCA 蛋白浓度测定试剂盒(中国wanleibio)测定蛋白含量。 加入20 μL 样品并在10%及15%聚丙烯酰胺凝胶上分离。 转印至PVDF 膜后用5%脱脂奶粉封闭1 h,用相应的抗体探测。 使用对应的免疫球蛋白试剂通过凝胶成像系统(WD-9413B 型,北京六一)观察印迹,用凝胶图象处理系统(Gel-Pro-Analyzer 软件)分析目标条带的光密度值。

1.3.8 真武汤对心肾阳虚型CHF 大鼠心肌组织LC3 和P62 表达影响

固定后的心肌组织依次进行包埋、透蜡、切片、抗原包被等程序,封片后于显微镜40×10 观察染色效果并拍照。

1.3.9 真武汤对心肾阳虚型CHF 大鼠心肌组织病理变化的影响

固定后的心肌组织进行脱水、透明、包埋、切片、染色等程序,封片后于显微镜40×10 下观察染色效果并拍照。

1.4 统计学方法

采用SPSS 21.0 统计学软件,进行多组间差别用单因素方差分析(One-Way ANOVA)进行统计,组间两两比较用方差分析后的LSD 检验。 实验数据以平均数±标准差()表示,检验结果以P＜0.05 为具有统计学意义,P＜0.01 为统计学有明显统计学意义。

2 结果

2.1 真武汤对心肾阳虚型CHF 大鼠一般情况影响

2.1.1 真武汤对心肾阳虚型CHF 大鼠自然情况影响

各给药组和模型对照组比较状态较好,活动较自如,症状有了明显改善,饮食、饮水基本恢复正常,皮毛相对柔顺而略有光泽,颜色由黄变淡,体重下降不明显,精神状态良好,较为活泼好动,生命体征总体好于模型对照组,结果见表1。

2.1.2 真武汤对心肾阳虚型CHF 大鼠体重、体温的影响

CHF 大鼠在造模后,体重下降趋势显著,与正常组比较有统计学意义(P＜0.05),虽然芪苈强心胶囊和真武汤高中剂量可以改善体重的降低,但并无明显差别(P＞0.05)。 体温也随着静脉注射阿霉素时间的增加有所下降,但无统计学意义(P＞0.05),结果见表2。

2.1.3 真武汤对心肾阳虚型CHF 大鼠心脏指数的影响

与空白组相比,心肾阳虚型心力衰竭大鼠心脏心脏指数虽有所增加,但无明显变化(P＞0.05),结果见表3。

2.2 真武汤对心肾阳虚型CHF 大鼠血流动力学的影响

血流动力学方面,模型对照组与空白对照组比较±dp/dpmax 变化十分明显(P＜0.01),+dp/dpmax下降至空白对照组值的35.5%,说明造模成功[7]。芪苈强心胶囊和真武汤各剂量都能够显著抑制±dp/dpmax 变化(P＜0.05),说明真武汤对心肾阳虚型心力衰竭大鼠心肌的收缩和舒张功能均有明显改善作用,结果如表4。

2.3 真武汤对心肾阳虚型CHF 大鼠血清T3、T4、TSH 含量的影响

除空白组外,T4的含量均较低(P＜0.05),说明甲状腺清除完整,各给药组可提高血清中T4含量,证明各给药组可以改善心肾阳虚型CHF 大鼠甲状腺功能；造模后大鼠血清TSH 的含量高于空白组(P＜0.05)。 证明造模后甲状腺功能降低,机体需要通过增加TSH 来刺激T4产生。 结果见表5。

2.4 真武汤对心肾阳虚型CHF 大鼠心肌BNP、LA、CaN 含量的影响

与正常组比较,心肾阳虚型CHF 大鼠心肌组织LA 水平有所降低(P＜0.05),CaN、LA 含量有所升高(P＜0.05),而各给药组均可对三个指标具有不同程度调节作用,其中高剂量组作用最强(P＜0.05 或P＜0.01),结果见表6。

表1 真武汤对心肾阳虚型心力衰竭大鼠自然情况影响(n=10)Table 1 Physiological state of heart-kidney yang deficiency and heart failure rats by ZW

表2 真武汤对心肾阳虚型心力衰竭大鼠体重、体温的影响(,n = 10)Table 2 Body weight and temperature of heart-kidney yang deficiency and heart failure rats by ZW

表2 真武汤对心肾阳虚型心力衰竭大鼠体重、体温的影响(,n = 10)Table 2 Body weight and temperature of heart-kidney yang deficiency and heart failure rats by ZW

注:与模型对照组比较,*P＜0.05Note.Compare with model group, *P＜0.05.

组别Groups体重(g)Weight体温(℃)Body temperature正常组Control 304.43±17.78* 38.47±0.17模型对照组CHF 248.40±32.80 37.42±0.50芪苈强心胶囊组QL 275.24±57.30* 37.08±0.62真武汤高剂量组ZWG 248.67±32.01* 37.00±0.33真武汤中剂量组ZWZ 251.62±56.30* 36.97±0.66真武汤低剂量组ZWD 209.61±19.33* 37.45±1.18

表3 真武汤对心肾阳虚型心力衰竭大鼠心脏指数的影响(,n=10)Table 3 Cardiac index of heart-kidney yang deficiency and heart failure rats by ZW

表3 真武汤对心肾阳虚型心力衰竭大鼠心脏指数的影响(,n=10)Table 3 Cardiac index of heart-kidney yang deficiency and heart failure rats by ZW

注:与模型对照组比较,*P＜0.05。Note.Compare with model group, *P＜0.05.

组别Groups剂量Dose心脏指数(g/kg)CWI正常组Control —— 2.6726±0.2064模型对照组CHF —— 2.8408±0.7152芪苈强心胶囊组QL 0.30 g/kg 2.8143±0.3638真武汤高剂量组ZWG 1.35 g/kg 2.9043±0.1667真武汤中剂量组ZWZ 0.81 g/kg 3.3972±0.1171*真武汤低剂量组ZWD 0.41 g/kg 3.0415±0.3002

表4 真武汤对心肾阳虚型心力衰竭大鼠血流动力学影响(,n=10)Table 4 Hemodynamics of heart-kidney yang deficiency and heart failure rats by ZW

表4 真武汤对心肾阳虚型心力衰竭大鼠血流动力学影响(,n=10)Table 4 Hemodynamics of heart-kidney yang deficiency and heart failure rats by ZW

注:与模型对照组比较,*P＜0.05,**P＜0.01。Note.Compared with the model group, *P＜0.05, **P＜0.01.

组别Groups剂量(g/kg)Dose左室最大上升速率(mmHg/s)+dp/dtmax左室最大下降速率(mmHg/s)-dp/dtmax正常组Control —— 5234.86±187.02** -5219.60±194.21**模型对照组CHF —— 1859.85±163.13 -1764.93±182.27芪苈强心胶囊组QL 0.30 3786.41±181.17** -3577.87±128.38**真武汤高剂量组ZWG 1.35 2943.28±153.96** -2839.27±173.52**真武汤中剂量组ZWZ 0.81 2441.53±149.23* -2521.64±160.86*真武汤低剂量组ZWD 0.41 2236.41±110.46 -2377.87±128.38

2.5 真武汤对心肾阳虚型CHF 大鼠心肌自噬相关蛋白的影响

Western blot 结果表明,与对照组比较,心肾阳虚模型CHF 大鼠心肌LC3、ATG5、BECLIN1 水平明显降低,而各给药组均能提高大鼠心肌组织中LC3、ATG5、BECLIN1 蛋白表达量。 与对照组比较,心肾阳虚模型CHF 大鼠心肌P62 水平变化不大,但各给药组均能降低P62 蛋白表达量,其中真武汤各组降低作用明显,结果见图1,由左至右依次为正常组,模型对照组,芪苈强心胶囊组,真武汤高、中、低剂量组,详见表7。

表5 真武汤对心肾阳虚型心力衰竭大鼠血液中T3、T4、TSH 的影响(,n = 10)Table 5 T3, T4, TSH of heart-kidney yang deficiency and heart failure rats by ZW

表5 真武汤对心肾阳虚型心力衰竭大鼠血液中T3、T4、TSH 的影响(,n = 10)Table 5 T3, T4, TSH of heart-kidney yang deficiency and heart failure rats by ZW

注:与模型对照组比较,*P＜0.05。Note.Compared with the model group, *P＜0.05.

组别Groups剂量(g/kg)Dose三碘甲腺原氨酸T3(nmol/L)血清总甲状腺素T4(nmol/L)促甲状腺激素TSH(nmol/L)正常组Control — 0.04±0.01 0.75±0.09* 0.68±0.16*模型对照组CHF — 0.05±0.01 0.51±0.01 0.80±0.12芪苈强心胶囊组QL 0.30 0.05±0.02 0.55±0.00* 0.82±0.09*真武汤高剂量组ZWG 1.35 0.05±0.01 0.57±0.02* 0.85±0.17真武汤中剂量组ZWZ 0.81 0.04±0.02 0.55±0.05* 0.83±0.19真武汤低剂量组ZWD 0.41 0.03±0.01 0.53±0.00* 0.83±0.19

表6 真武汤对心肾阳虚型心力衰竭大鼠血液中LA、CaN、BNP 的影响(,n=10)Table 6 LA, CaN, BNP of heart-kidney yang deficiency and heart failure rats by ZW

表6 真武汤对心肾阳虚型心力衰竭大鼠血液中LA、CaN、BNP 的影响(,n=10)Table 6 LA, CaN, BNP of heart-kidney yang deficiency and heart failure rats by ZW

注:与模型对照组比较,*P＜0.05,**P＜0.01。Note.Compared with the model group, *P＜0.05, **P＜0.01.

组别Groups剂量(g/kg)Dose乳酸LA(nmol/L)钙调神经磷酸酶CaN(nmol/L)脑钠肽BNP(nmol/L)正常对照组Control - 16.96±0.76* 1.35±0.30* 1.07±0.22*模型对照组CHF - 16.30±0.37 1.83±0.29 1.31±0.22芪苈强心胶囊组QL 0.30 17.96±1.88* 1.45±0.30* 0.91±0.38*真武汤高剂量组ZWG 1.35 16.85±0.70* 1.33±0.29** 0.96±0.25**真武汤中剂量组ZWZ 0.81 16.57±0.57 1.49±0.25* 1.02±0.25**真武汤低剂量组ZWD 0.41 16.33±0.67 1.55±0.21* 1.26±0.24

表7 真武汤对心肾阳虚型心力衰竭大鼠心肌自噬相关蛋白相对蛋白含量的影响(,n=10)Table 7 Autophagy related protein of heart-kidney yang deficiency CHF rats by ZW

表7 真武汤对心肾阳虚型心力衰竭大鼠心肌自噬相关蛋白相对蛋白含量的影响(,n=10)Table 7 Autophagy related protein of heart-kidney yang deficiency CHF rats by ZW

注:与模型对照组比较,*P＜0.05,**P＜0.01,***P＜0.001。Note.Compared with the model group, *P＜0.05, **P＜0.01, ***P＜0.001.

组别Groups 剂量(g/kg)Dose LC3 ATG5 Beclin1 P62正常对照组Control - 1.00±0.00*** 1.00±0.00*** 1.00±0.00* 1.00±0..00*模型对照组CHF - 0.66±0.11 0.71±0.23 0.95±0.07 1.13±0.18芪苈强心胶囊组QL 0.30 1.80±0.13*** 1.69±0.23*** 1.70±0.21*** 0.97±0.13*真武汤高剂量组ZWG 1.35 2.77±0.15*** 1.73±0.24*** 1.73±0.18*** 0.81±0.24**真武汤中剂量组ZWZ 0.81 2.83±0.13*** 2.01±0.23*** 1.20±0.22** 0.68±0.16***真武汤低剂量组ZWD 0.41 2.52±0.12*** 2.02±0.28*** 1.73±0.14*** 0.81±0.17***

图1 心肌组织LC3(a)、ATG5(b)、BECLIN1(c)、P62(d)表达结果Figure 1 Results of LC3 (a), ATG5 (b), BECLIN1 (c), P62 (d) in myocardial tissue

2.6 真武汤对心肾阳虚型CHF 大鼠心肌组织LC3 和p62 表达影响

免疫组织化学染色结果显示,与空白对照组比较,模型对照组心肌BECLIN1、P62 表达量降低,各给药组可以升高心肾阳虚型CHF 导致的P62 表达量的降低,见图2。

2.7 真武汤对心肾阳虚型CHF 大鼠心肌组织影响

HE 染色结果可见:空白对照组心肌纤维间连接密集、纤维间分布平整,细胞与细胞之间距离正常；模型对照组心肌细胞边缘不整,大面积心肌纤维溶断,细胞间距加宽,心肌纤维排列混乱,存在局部炎性细胞浸润现象,心肌组织产生局部水肿；各给药组可使模型对照组的心肌细胞得到好的治疗改善,结果见图3。

3 讨论

慢性心力衰竭中医证型分类方式繁多各有侧重,目前还没有统一的标准。 相对比较权威的《中医新药临床研究指导原则》[8]辩证标准将本病分为7 个证型。 疾病的初期病理变化是心肺气虚。 病情进一步进展则是气阴两亏、气虚血疲。 而慢性心力衰竭较严重的阶段则是心肾阳虚、阳虚水泛、痰饮阻肺。 在实验的过程中,我们通过手术将实验用大鼠两侧甲状腺切除,再对它进行尾部静脉注射阿霉素之后,实验大鼠主要表现出毛皮灰黄、呼吸微弱、精神萎靡、畏寒蜷缩、大便溏泻的症状,这些生命体征与人类中医证候心肾阳虚证型非常相像[9]。 基源于此,我们认为这组大鼠的表现与模拟的心肾阳虚证候十分吻合,根据上述研究内容,我们在建立心肾阳虚证的动物模型时,可以参考上述方案。

图2 免疫组化检查结果Note.A, Control.B, Model.C, QL.D, ZWG.E, ZWZ.F, ZWD.Compared with the model group, ***P＜0.001.Figure 2 Results of IHC

图3 光镜检查结果Figure 3 Results by light microscopy

经过大量的临床和动物实验已经证实,阿霉素在长期应用时可出现难以恢复的心脏毒性作用,而且由于阿霉素与心肌组织亲和力显著强于其他组织,因此可出现剂量不可逆的依赖性心肌损伤[10],可能与其机制相关的因素有:基因突变[10-11]；核酸、脂质过氧化[12]；Ca2+超载[13]；能量代谢障碍[14-15]；自由基损伤[16]；产物的直接性损害[17]等。 目前,腹腔间断性注射阿霉素已经被广泛应用于慢性心力衰大鼠模型的建立[18-19],并被认为能够高度模仿人体慢性心力衰竭的神经-内分泌机制和血流动力学的改变,与其它造模方法相比,该法具有方法简单和复制性高的优点。 因此本研究认为尾静脉注射阿霉素造成的心力衰竭模型能更好地用于益气温阳抗心衰的治疗性研究。

本研究结果显示,真武汤可以降低心肾阳虚型心力衰竭大鼠心肌组BNP 含量,说明其对心衰症状具有改善功能。 LA 作为运动时物质代谢的产物,模型动物LA 含量降低说明心肌细胞功能下降,而真武汤能够升高心肌组织LA 含量,降低CaN 含量,说明真武汤能够改善心脏能量代谢。 心肾阳虚型CHF 大鼠心肌自噬相关蛋白LC3、ATG5、BECLIN1含量降低,P62 含量升高,说明心力衰竭初期心肌细胞有大量细胞发生自噬,真武汤可以升高心力衰竭大鼠自噬相关指标LC3、ATG5、BECLIN1 含量,降低P62 含量,说明真武汤在心力衰竭初期可以通过调节自噬保护损伤的心肌细胞。

综上所述,在进行有关针对心肾阳虚型CHF 模型的构建的研究时,可以应用阿霉素尾静脉注射的方法,本研究认为尾静脉注射阿霉素造成的心力衰竭模型能更好地用于益气温阳抗心衰的治疗性研究,并且,在临床中针对本有不同程度符合心肾阳虚证型的慢性心力衰竭的患者,可以加以应用真武汤进行辨证论治。