姜黄素改善慢性阻塞性肺疾病患者糖皮质激素抵抗现象的研究

秦柯 郭雪君

上海交通大学医学院附属新华医院呼吸科200092

COPD 是一种严重危害人类健康、影响长期生活质量的慢性呼吸系统疾病,是以气流受限为特征的可以预防和治疗的疾病,气流受限呈不完全可逆、进行性发展。遗传和环境共同作用是COPD的主要危险因素。COPD 的发病机制较为复杂,目前认为主要与香烟烟雾等有害颗粒或有害气体作用于气道,使气道发生异常炎症反应有关,遗传因素可能参与其中。同时机体氧化与抗氧化平衡紊乱、蛋白酶和抗蛋白酶机制失衡进一步加重肺组织的炎症,血管内皮损伤继而引起血管重塑可促使COPD病情恶化。此外,近年来有研究发现内质网应激在COPD 发生、发展中也发挥一定作用[1]。

糖皮质激素是治疗COPD 的常用药物,尤其对于急性加重期的患者。但许多COPD 患者对糖皮质激素治疗的反应较差,治疗后肺功能并未得到有效改善,炎症未得到有效控制,进一步研究发现这部分患者可能存在糖皮质激素抵抗现象[2-3],多种机制可能参与其中:中性粒细胞、巨噬细胞及其他炎症细胞聚集在气道和肺组织中引起的慢性气道炎症[4]、 组蛋白去乙酰化酶 2 (histone deacetylases,HDAC2)活性下降[5]、激素受体亚型及翻译修饰异常[6]、核因子κB (nuclear factor kappa B,NF-κB)通路激活障碍[7]等,其中HDAC2活性降低被认为是导致激素抵抗的主要原因。姜黄素是一种从天南星科和姜科植物根茎中提取的多酚类化合物,其分子结构为含β-二酮的庚二烯和两个邻甲基化的酚相连所组成,是WHO 和美国食品药品管理局以及多国准许使用的食品添加剂,目前为世界上销量最大的天然食用色素之一,也是常用的中药之一。已确定姜黄素具有多种药理活性:包括抗炎、抗氧化应激、抗肿瘤以及免疫调节等,这些生物学效应为肺部疾病、心血管疾病、消化系统疾病、糖尿病、恶性肿瘤等多种疾病的治疗提供了新思路,使其成为目前研究的热点之一。

近年来研究发现姜黄素可以通过多种机制改善COPD 患者糖皮质激素抵抗现象。具体机制包括有:姜黄素可抑制 NF-κB、转录激活因子(activator protein-1,AP-1)、磷脂酰肌醇3 激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)等分子活性,减弱组蛋白乙酰化酶活性,增加HDAC2 表达[8]。姜黄素还可以通过干预磷酸化-泛素-蛋白酶体途径,提高HDAC2的活性[9]。上述研究大多基于动物实验,本研究采用COPD 患者外周血为研究对象,通过分离得到其外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC),建立COPD 体外细胞模型,探讨COPD 患者的糖皮质激素抵抗现象。为COPD 患者的治疗提供了新思路,同时为姜黄素早日应用于临床奠定重要的基础。

1 对象与方法

1·1 研究对象 2018年6月至2019年6月于上海交通大学医学院附属新华医院呼吸科住院的COPD 患者30例,年龄 (66.2±8.49)岁,年龄范围为50～80岁;健康者30名,年龄 (66.37±6.00)岁,年龄范围为50～80 岁。2 组年龄差异无统计学意义。本研究经上海新华医院伦理委员会同意(XHEC-D-2020-086),且患者均知情同意并签署知情同意书。

1·2 纳入标准

1·2·1 COPD 组 符合COPD 的诊断标准,具有一种或者多种呼吸系统症状,如慢性咳嗽、咳痰、气喘、呼吸困难等。肺功能检查提示,使用支气管舒张剂后,第1 秒用力呼气容积 (forced expiratory volume in one second,FEV1)/FVC＜70%。

1·2·2 健康组 无吸烟史;无COPD、哮喘等疾病;肺功能检查提示肺功能正常者;经伦理委员会同意,且均签署知情同意书。

1·3 排除标准 近3个月曾经应用激素者;近1个月应用过大环内酯类抗生素;合并支气管哮喘、肺结核、支气管肺癌或其他呼吸系统疾病。

1·4 观察指标 各组研究对象中IL-8、IL-6以及基质金属蛋白酶9 (matrix metalloproteinases-9,MMP-9)的含量。

1·5 试验方法

1·5·1 提取PBMC 每例正常组抽取5 ml外周血,COPD 患者抽取双份5 ml血于EDTA 管中(第2份用于姜黄素部分研究用),与等量的PBS混匀。在离心管中加入淋巴细胞分离液,淋巴细胞分离液与血样1∶1。室温离心后分别得到PBMC。1·5·2 培养PBMC 胎牛血清与RPMI培养液1∶10制成培养基,将洗涤后的PBMC 重悬至浓度为1×106个/ml,每份外周血在24孔板中均分为7个孔进行培养,每孔1 ml,每孔各加入植物血凝素(其终浓度为50 mg/L),严格保证各组细胞数差异无统计学意义,并做好标记。

1·5·3 制备不同浓度的地塞米松 制备浓度为10-10mol/L～10-5mol/L的地塞米松试剂。

1·5·4 激素干预 取上述30 名健康者及30 例COPD 患者(第一份血标本)PBMC,以不同浓度的地塞米松 (10-10mol/L～10-5mol/L)分别干预,在无菌条件下 (50 ml/L CO2,37 ℃,湿度100%)培养48 h。48 h后应均进行半量换液,同时加入肿瘤坏死因子α (tumor necrosis factor-α,TNF-α)共培养,TNF-α 终浓度为0.1μg/L,共96 h后培养结束。以2 000 r/min离心20 min (离心半径15 cm),离心后获取上清液及单个核细胞。再次进行细胞计数,保证培养后各组间的细胞计数(包括组内及组间)差异无统计学意义,否则予以剔除。

1·5·5 制备不同浓度的姜黄素 制备浓度为1×10-10mol/L～1×10-5mol/L的姜黄素试剂。

1·5·6 分组药物干预 取第2份分离得到的30例COPD 患者PBMC,各组细胞数差异无统计学意义。制备姜黄素组:姜黄素 (1×10-10mol/L～1×10-5mol/L);姜黄素(1×10-7mol/L)+地塞米松(1×10-10mol/L～1×10-5mol/L)。在无菌条件下(50 ml/L CO2,37 ℃,湿度100%)培养48 h。48 h后应均进行半量换液,同时加入TNF-α共培养,TNF-α终浓度为0.1μg/L,共96 h后培养结束。离心后获取上清液及单个核细胞。再次进行细胞计数,保证培养后各组间的细胞计数(包括组内及组间)差异无统计学意义,否则予以剔除。

1·5·7 检测炎症因子含量 酶联免疫吸附试验法检测各组上清液中IL-8、IL-6 以及MMP-9 的含量,按照公式计算各炎症因子抑制率,各炎症因子的抑制率(%)= (1-实验组平均吸光度OD 值/对照组平均吸光度OD 值)100%。

1·6 统计学分析 采用SPSS统计软件进行分析,正态分布的计量资料采用±s 表示,组内比较采用配对t检验,组间比较采用方差分析,P ＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2·1 一般情况比较 COPD 组与健康组的性别、年龄差异无统计学意义(χ2=1.733,t=-0.168,P 值均＞0.05)。见表1。

2·2 不同浓度地塞米松对各炎症因子的抑制作用 COPD 患者组中不同浓度地塞米松对IL-8的抑制率均明显低于正常组,差异均有统计学意义(P 值均＜0.01)。见表2。COPD 患者组中不同浓度地塞米松对IL-6 的抑制率均明显低于正常组,差异均有统计学意义 (P 值均＜0.01)。见表3。COPD患者组中不同浓度地塞米松对MMP-9的抑制率均明显低于正常组,差异均有统计学意义(P 值均＜0.01)。见表4。且在COPD 患者组中,当地塞米松浓度达到1×10-7mol/l后,各炎症因子的抑制率逐渐趋于稳定,而在正常组中,随着地塞米松浓度的升高,各炎症因子抑制率持续升高。见表2～4,图1。

表1 一般情况的比较)

表2 不同浓度地塞米松对2组IL-8的抑制率的比较 (%)

2·3 各炎症因子IC50-Dex 值比较 COPD 组中IL-8的IC50-Dex值(2.72×10-6mol/L)明显高于正常组 (1.08×10-9mol/L)。COPD 组中IL-6 的IC50-Dex值(4.31×10-7mol/L)明显高于正常组(8.34×10-10mol/L)。COPD 组中MMP-9的IC50-Dex 值 (4.19×10-6mol/L)明显高于正常组(2.30×10-9mol/L)。

2·4 姜黄素作用下各炎症因子的抑制率 在COPD 患者组中,与单用地塞米松组相比较,地塞米松+姜黄素组的IL-8的抑制率明显提高,差异有统计学意义 (P ＜0.01)。见表5,图2。与单用地塞米松组相比较,地塞米松+姜黄素组的IL-6的抑制率明显提高,差异有统计学意义 (P ＜0.01)。见表6,图2。与单用地塞米松组相比较,地塞米松+姜黄素组的MMP-9 的抑制率明显提高,差异有统计学意义 (P ＜0.01)。见表7,图2。

2·5 姜黄素作用下各炎症因子IC50-Dex值比较

在COPD 组中,与单用地塞米松相比,姜黄素+地塞米松组中各炎症因子的IC50-Dex值明显减小。IL-8的IC50-Dex 值在单用地塞米松组为2.72×10-6mol/L,明显高于姜黄素+地塞米松组(1.20×10-9mol/L);同理,IL-6 的IC50-Dex值在单用地塞米松组为4.31×10-7mol/L,明显高于姜黄素+地塞米松组 (3.32×10-10mol/L);MMP-9 的IC50-Dex值在单用地塞米松组为4.19×10-6mol/L,明显高于姜黄素+地塞米松组(3.25×10-9mol/L)。

表3 不同浓度地塞米松对2组IL-6的抑制率的比较 (%)

表4 不同浓度地塞米松对2组MMP-9的抑制率的比较 (%)

图1 地塞米松作用下各组炎症因子抑制率 A:IL-8;B:IL-6;C:MMP-9

3 讨论

3·1 COPD 患者糖皮质激素抵抗现象 近年来,COPD 的发病率逐渐上升,目前认为该疾病与肺对有害气体或颗粒的异常炎症反应有关,吸烟是最常见的危险因素,其他还包括吸入生物燃料、粉尘及其他有害气体等。其发病机制与以中性粒细胞、巨噬细胞和CD8+T 淋巴细胞为主的慢性炎症、蛋白酶与抗蛋白酶失衡、氧化与抗氧化失衡及气道重塑等相关[10-11]。临床主要表现为慢性咳嗽、咳痰、气促、呼吸困难,晚期可合并心功能不全等症状,对患者日常生活造成了长久的负担[12]。目前COPD主要治疗原则是改善症状,防止急性发作,减缓并发症,因糖皮质激素可有效抑制炎症反应、缓解肺毛细血管渗漏、减轻气道黏膜水肿,故在COPD患者中糖皮质激素成为控制症状及改善预后的主要药物[11]。研究发现,不同的个体对激素的反应状况具有差异,部分个体对糖皮质激素无反应或者反应性明显降低,称为糖皮质激素抵抗[13-14]。近年来,许多研究发现COPD 患者治疗中可能存在糖皮质激素抵抗现象[15-16]。具体机制可能与HDAC的减少[5,17]、糖皮质激素受体亚型转变[6]以及炎症因子作用[16,18]等相关。

表5 COPD 患者中分组药物干预下IL-8的抑制率 (%)

表6 COPD 患者中分组药物干预下IL-6的抑制率 (%)

表7 COPD 患者中分组药物干预下MMP-9的抑制率 (%)

图2 分组药物干预下各炎症因子抑制率 (COPD组) A:分组药物干预下IL-8抑制率;B:分组药物干预下IL-6抑制率;C:分组药物干预下MMP-9抑制率

IL-8主要由单核细胞、中性粒细胞、气道上皮细胞、内皮细胞、淋巴细胞等分泌,具有多种生物学功效,是中性粒细胞的主要趋化因子。IL-8的趋化作用可以促使中性粒细胞大量表达黏附分子,引发呼吸爆发,诱发较强的炎症反应[19]。IL-6是由单核巨噬细胞、血管内皮细胞以及T 细胞等分泌,而且具有多种生物学效应的细胞因子,在低氧环境中,可诱导多种炎症因子,研究发现[20],COPD 患者外周血清中,IL-6水平明显升高,而且与FEV1%pred 呈负相关,可做为评估COPD患者预后的指标之一[21]。MMP-9是由活化的中性粒细胞分泌的金属蛋白酶,有研究表明,在COPD 发病过程中,MMP-9会对肺泡基质构成破坏,并能介导炎症细胞聚集以及损害上皮及内皮细胞结构,促进气道重塑。在中重度COPD 患者中,MMP-9 m RNA 表达水平与FEV1、FEV1/FVC 呈负相关[22]。故本研究通过测定外周血中以上3种炎症因子的含量,间接反应COPD 患者的炎症程度。

本研究通过采用体外实验,分离培养得到PBMC,每个样本均给予不同浓度地塞米松干预,同时设置空白对照。结果发现,在COPD 患者组中,地塞米松对单个核细胞释放的炎症因子(IL-8、IL-6和MMP-9)的抑制作用较正常组明显减弱;且在COPD 患者组中,当地塞米松浓度达到1×10-7mol/L 时,继续增加地塞米松的浓度,各炎症因子抑制率无明显变化。综上表明COPD患者存在糖皮质激素抵抗现象。

3·2 姜黄素改善COPD 患者的糖皮质激素抵抗现象 姜黄素是姜科姜黄属植物干燥根茎中的一种天然有效成分,具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤[23-24]等多种活性,药理作用广泛,毒性低,且不良反应小[25]。目前研究表明,姜黄素通过清除自由基[26],抑制环氧合酶[27]、脂肪氧化酶和诱生型一氧化氮合成酶活性,抑制TNF-α 和NF-κB 表达[28-29],以及调节基因的表观遗传等发挥作用。近年,姜黄素的抗炎作用一直是研究的重点[30]。在肺泡上皮细胞中,姜黄素能够抑制由过氧化氢[31]和TNF-α 引起的IL-8 的释放,降低AP-1[32]和NF-κB活性,上调谷胱甘肽水平。

前期体外细胞学研究发现,姜黄素能部分降低COPD 大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞IL-8、MCP-1、巨噬细胞炎性蛋白 (macrophage inflammatory protein 2α,MIP-2α)的H3、H4 位乙酰化水平,升高H3K9位点的甲基化水平。在COPD 大鼠体外实验的研究中发现,姜黄素可以逆转香烟烟雾提取物诱导的布地奈德抵抗,在RAW264.7细胞和RTE 细胞中,与LPS+CSE+布地奈德相比,LPS+CSE+姜黄素+布地奈德组的IC50-布地奈德显著降低(P ＜0.05)。实验结果显示姜黄素具有逆转糖皮质激素抵抗的作用,对于COPD 等激素抵抗型疾病,姜黄素具有潜在的治疗价值。

本研究拟采用COPD 患者PBMC为研究对象,通过分组药物干预培养,检测上清液中IL-8、IL-6及MMP-9的含量,根据本实验结果可发现,姜黄素对COPD 患者糖皮质激素抵抗现象具有明显改善作用。姜黄素改善糖皮质激素抵抗现象可能与其增强HDAC2的活性表达相关[9,33]。HDAC2属于组蛋白去乙酰化酶的一个亚型,在香烟烟雾等有害颗粒的应激作用下活性明显降低,可促使炎症因子如IL-8、TNF-α等表达增强,在COPD 患者炎症反应调控中发挥重要的作用[34]。姜黄素提高HDAC2表达的相关具体机制可能如下:(1)姜黄素可抑制NF-κB、转录激活因子AP-1、磷脂酰肌醇3激酶等分子活性,减弱组蛋白乙酰化酶活性,增加HDAC2表达[8,35]。(2)姜黄素可通过抑制磷酸化的细胞外信号调节激酶,提高HDAC2 的表达。 (3)姜黄素可干预磷酸化-泛素-蛋白酶体途径,提高HDAC2的活性[9]。

尽管姜黄素具有以上多种生物活性,但姜黄素自身稳定性差,难溶于水,在体外易被氧化,在体内经胃肠道代谢易失活,难被人体吸收[36],故为其推广应用带来了一定的难度,也是姜黄素类化合物尚未开发成新药的根本原因,因此,如何提高姜黄素的水溶性及生物利用度是以后积极探讨的重要内容,也是姜黄素能够早日应用于临床的关键问题。总之,本研究发现姜黄素能够改善COPD 患者糖皮质激素抵抗现象,为COPD 患者临床治疗提供了新思路。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突