氯化铯增加人诱导多能干细胞来源心肌细胞自发动作电位的节律性

杨礼，宫艺其，吴蕾，张侃，付炜，王伟，郑吉建，朱明

1.复旦大学附属肿瘤医院麻醉科，复旦大学上海医学院肿瘤学系，上海200032；2.上海交通大学附属上海儿童医学中心心胸外科，上海200127；3.上海交通大学附属上海儿童医学中心麻醉科，上海200127

随着人口老龄化的日益加速，心肌梗死和心力衰竭等心脏疾病的发生率逐年上升。既往研究表明，人诱导多能干细胞来源心肌细胞（human induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes,hiPSC-CM）移植在治疗心肌梗死、心力衰竭等心脏疾病显示出良好的应用前景[1,2]。然而，不同于正常的心房和心室肌，绝大多数hiPSC-CM 具有自发性节律[3,4]。将具有自发节律性的hiPSC-CM 移植到跳动的心脏后不仅可能影响正常的心脏跳动，而且存在不同的药物反应性[5]。故研究hiPSC-CM 的自发节律性调控机制，能让其更好的用于临床。而HiPSC-CM 的自发节律性与细胞膜上的各种离子通道活动密切相关。起搏电流在起搏细胞的自发节律性中起着关键作用，而hiPSC-CM上亦存在有超极化激活的起搏电流。氯化铯为经典的起搏电流阻断剂，可通过阻断钾电流而抑制起搏电流。氯化铯是否通过影响起搏电流导致hiPSC-CM 的自发性节律的改变，目前仍不清楚。本研究采用转化培养的hiPSC-CM 和膜片钳技术探讨氯化铯对hiPSC-CM自发动作电位和起搏电流的影响。

1 材料与方法

1.1 人诱导多能干细胞分化为心肌细胞 人诱导多能干细胞由上海儿童医学中心李彦欣教授课题组提供。首先鉴定人诱导多能干细胞的干性，方法为：预先铺好基质胶（美国Corning 公司354234）后，将1×105个/孔细胞接种于24 孔板玻璃爬片上。直至细胞融合至40%～50%时，使用4%的多聚甲醛在室温下固定细胞20 min，然后使用0.5%TritonX-100 室温破膜30 min，再用10%山羊血清室温下封闭30 min，最后添加tra-1-60 抗体（德国Merck Millipore 公司MAB4360），sox2 抗体（美国Epitomics 公司2683-1），nanog 抗体（美国Epitomics 公司3369-1），oct4 抗体（美国Epitomics 公司2876-1）（1: 200）4℃孵育过夜。PBS 清洗三遍后添加相应荧光二抗（1: 1000），室温下避光孵育120 min。dapi（1: 1000）室温核染10min 后使用激光共聚焦显微镜观察。

心肌分化方法为：人诱导多能干细胞由Accutase消化酶（7920,STEMCELL Technologies,Canada）消化成单个细胞后按1×106个/孔接种于提前铺好基质胶的12 孔板。直至细胞完全融合后再加入含12M CHIR99021（加拿大Stemcell公司72054）的RPMI1640（美国Thermo 公司11875093）/B27 minus insulin（美国Thermo 公司A1895601）分化培养基（加拿大Stemcell 公司05990）。培养24 h 后再更换为普通的RPMI1640/B27 minus insulin 培养基。继续培养48 h后再加入5M IWP-2（加拿大Stemcell 公司72124）的RPMI1640/B27 minus insulin 分化培养基。再过48 h后更换为普通RPMI1640/B27 minus insulin 培养基。再过48h 更换RPMI1640/B27 培养基，后每更换1 次RPMI1640/B27 培养基维持培养，直至第60 天。

1.2 hiPSC-CM的分子生物学鉴定 预先铺好基质胶后，将1×105个/孔细胞接种于24 孔板玻璃爬片上。用4%的多聚甲醛在室温下固定细胞20 min，再用0.5%TritonX-100 室温下破膜30 min，10%山羊血清室温下封闭30 min，再添加cTnT 抗体（美国Proteintech 公司15513-1-AP）4℃孵育过夜。最后用PBS 清洗3 遍，添加相应荧光二抗（1:1 000）室温避光孵育120 min。dapi（1: 1000）室温核染10 min 后使用激光共聚焦显微镜观察。

1.3 单个hiPSC-CM 的制备 将35 mm 孔径培养皿中培养60d hiPSC-CM（由上海市儿童医学中心王伟教授提供）用Accutase 消化酶1mL 消化20 min～40 min（37℃），使用倒置显微镜动态观察细胞消化情况，直到扁平铺开的细胞出现裂解，再用记录动作电位的细胞外液从培养皿的一侧持续灌流，培养皿的另外一侧使用负压泵持续吸引，调节灌流速度和负压吸引速度，维持培养皿内的液体处于相对稳定的液面高度。灌流后在显微镜下可见培养皿内的细胞恢复跳动，收缩变圆成单个细胞（图1）。室温（20～24℃）下保存，时间不超过6h。

1.4 电生理学方法 在倒置显微镜（ECLIPSE Ti-U,Nikon,Japan）下选择单个饱满贴壁并且折光度好的细胞进行试验。使用微电极拉制仪（美国SUTTER 公司P-97 微电极拉制仪）将微玻璃电极拉制好以后充满电极内液，并测试电极电阻，可选择阻抗在2 ～4 M的电极用于试验。可用1 mL 注射器在玻璃电极入水前给予0.5 mL 的正压，防止电极入水后电极尖端被空气浴液界面上积聚的灰尘或溶液中的离子污染，进而妨碍紧密封接的形成。通过微操纵仪将玻璃微电极缓慢推向细胞表面附近直至紧贴细胞，动态监测电极电阻的变化，当封接阻抗大于1 G时，稳定1 min 后用5mL 的注射器负压吸破细胞膜，快速补偿电容电流和串联阻抗（补偿40%～80%）形成全细胞记录状态。

采用电流钳记录自发动作电位（膜片钳电信号放大器：美国Axon 公司700B；膜片钳数模转换器：Digidata 1550A,Axon Instruments,Inc.,Union City,CA,USA），使用gap-free 模式记录，动作电位记录信号的采样频率为1 kHz，低通Bessel滤波频率为0.5 kHz；采用电压钳记录起搏电流，起搏电流信号的低通Bessel滤波频率为2 kHz，采样频率为10 kHz。起搏电流的刺激程序为：钳制膜电位于-50 mV，阶跃电压设置为-10 mV，超极化至-150 mV，超极化持续时间为3 s，在各指令电压结束后再除极化到20 mV 测试尾电流，除极化持续时间为0.5 s。采用“Y-tube”系统灌流给药，灌流速度为3 mL/min。每次灌流液体10 mL（约为培养皿内液体的5 倍）可基本置换培养皿内的液体。既往研究表明，浓度为2 mM 的氯化铯可明显抑制起搏电流[4]，故本实验前用细胞外液将氯化铯（Sigma 公司）配置浓度为2 mM。

液体配方如下：动作电位所用细胞外液（mM）：NaCl 140,KCl 5,CaCl21,MgCl21,Glucose 10,HEPES 10（pH 7.4,NaOH）；动作电位电极内液（mM）：KCl 150,NaCl 5,CaCl22,EGTA 5,HEPES 10,MgATP 5（pH 7.2,KOH）；起搏电流细胞外液（mM）：NaCl 137.7,KCl 5.4,MgCl21,CaCl21.8,HEPES 5,NaOH 2.3,glucose 10,4-aminopyridine 2,BaCl25,CdCl20.2（pH 7.4,NaOH）；起搏电流电极内液（mM）：NaCl 6,K-aspartate 130,MgCl22,CaCl22,EGTA 5,Na2ATP 2,NaGTP 0.1,cAMP 0.2,HEPES 5（pH 7.2,KOH）。

1.5 统计学分析 数据资料采用Clampfit 10.5 和Origin 8.0 软件进行数据分析。Clampfit 软件主要用于图像的采集、数据的测量；Origin 8.0 主要用于各种线图的制作及各种示意图的编辑。结果以均数±标准差（±SD）表示。样本量（number，n）表示所记录心肌细胞的数量，每组数据记录5 个心肌细胞。数据的统计分析使用配对或不配对的 检验分析两组之间的均数差异；采用方差分析比较多组之间的差异。＜0.05 认为有统计学差异。

2 结果

2.1 人诱导多能干细胞的干性鉴定及转化心肌细胞的分子生物学鉴定 前期研究表明，人诱导多能干细胞免疫荧光染色显示细胞核内多能性标志物oct4，sox2，nanog 及细胞表面多能性标志物tra-1-60 为强阳性表达。免疫荧光染色显示hiPSC-CM 上表达心肌细胞特异性标志物cTnT[6,7]。

2.2 hiPSC-CM 自发动作电位的特性 显微镜下观察，hiPSC-CM 消化前呈条索状，扁平贴于培养皿，可见自发跳动（图1a）；消化后呈圆形或椭圆形，显微镜下折光度增强（图1b）。所记录hiPSC-CM 动作电位具有自发节律性（图1c），动作电位具有明显的平台期（图1d）。

2.3 氯化铯对hiPSC-CM 动作电位频率、静息电位、振幅、90%复极时间的影响 2 mM 氯化铯增加hiPSCCM 自发动作电位的频率（=0.003,= 5，图2b），提高动作电位的静息电位（＜0.001,=5，图2c），降低动作电位的振幅（=0.002,=5，图2d），缩短动作电位APD90（＜0.001,=5，图2e）。

2.4 氯化铯对hiPSC-CM起搏电流的影响 所记录hiPSC-CM 均有起搏电流，起搏电流为超极化激活的内向电流，具有平台期电流和尾电流（图3a）。2 mM 氯化铯明显抑制起搏电流的平台期电流（＜0.05,=5）（图3b）以及尾电流（＜0.05,=5）（图3c）。

3 讨论

氯化铯因可通过阻断钾电流而抑制起搏电流，而成为经典的阻断起搏电流的工具药。因其与钾具有相似的生物学特性，临床上可作为甲状腺癌的阳性显像剂，亦可作为心肌灌注显像剂；还有学者提出氯化铯可通过提高机体的pH 值而用于恶性肿瘤的治疗，即氯化铯的高pH 值疗法。氯化铯在临床应用时，有报道称可引起心律失常，严重的还可引起危及生命的心脏疾病。本研究发现，氯化铯增快hiPSC-CM 自发动作电位的频率，提高hiPSC-CM 动作电位的静息电位，降低动作电位的振幅以及缩短APD90，并明显抑制起搏电流的平台期电流以及尾电流。本研究在探讨氯化铯临床应用时引起心脏不良反应具有参考价值，氯化铯可改变心室肌细胞的节律性，有引发室性心律失常的风险。

所记录hiPSC-CM 自发动作电位均具有明显平台期，提示所记录均为心室肌样细胞，且均具有自律性。氯化铯可增强该自律性，即氯化铯增快hiPSC-CM 自发动作电位的频率。窦房结相关研究表明，正常窦房结起搏细胞的超极化激活电流幅度对起搏细胞自发节律的快慢起着重要作用，超极化电流持续时间决定了自发性节律的间隔时间[8]，如超级化电流受到抑制，则会引起自发性节律降低。而超极化电流主要由起搏电流构成。故抑制起搏电流可使窦房结起搏细胞的自律性降低。而本研究中氯化铯明显抑制hiPSC-CM 的起搏电流，却使hiPSC-CM 自发动作电位的频率增快。这与既往的研究结果氯化铯抑制窦房结细胞的自律性不同。起搏细胞的自律性除受膜时钟（起搏电流等）控制，还受细胞内钙时钟的调节[9]。细胞内周期性的钙释放在细胞的自律性中起着关键性作用。具体在膜时钟和钙时钟之间，哪个占据主导地位仍有待进一步研究。氯化铯是否通过影响细胞内钙时钟节律来增加自发动作电位的节律仍不清楚，还有待进一步研究。另外，hiPSC-CM 心室肌样细胞具有自律性仍是其不成熟的标志之一，如何消除其自律性目前仍不清楚。hiPSC-CM 是否具有与人体正常起搏细胞不同的起搏机制亦有待进一步研究。

另有研究表明[10]，氯化铯可引起QT 间期延长导致室性心律失常，其机制可能是通过抑制IK1 而致复极延长诱发早后除极。当早期后除极的除极幅值达到邻近细胞的阈电位后，可以引起临近细胞产生一个动作电位甚至一串动作电位，造成室性心律失常。本试验的研究对象为单个细胞，不受邻近细胞的影响，亦不受自主神经的调控，氯化铯仍可引起hiPSC-CM 自发动作电位的频率增加，表明其与氯化铯对单个hiPSC-CM 的直接作用有关。这说明了hiPSC-CM 与正常的心室肌细胞仍存在差异，Sayaka Yonemizu 等人的研究显示在hiPSC-CM 上未能检测到T 型钙通道和缓慢激活延迟整流钾通道电流[4]，Gracious R.Ross 等人的研究亦显示不同的培养时间下hiPSC-CM 的Na+电流以及Ca2+电流特性存在差异[11]，而细胞的节律性与细胞上面的离子通道的活动密不可分，氯化铯具体通过影响何种离子通道改变hiPSC-CM 的节律性仍有待后续研究。通过对动作电位的进一步分析，可见氯化铯提高静息电位，提高了细胞的兴奋性。氯化铯还引起APD90 的缩短，APD90 缩短可导致自发性动作电位的间隔时间缩短，从而加快自发性动作电位的节律。一般认为，心肌细胞的钙通道和/或钾通道是APD90 的主要影响因素。因此，氯化铯对hiPSC-CM钙和/或钾通道电流的影响还需要进一步研究。另外，本研究仍有许多不足之处，如研究显示hiPSC-CM 成熟度低，存在较大异质性[5]，该研究宜收集更多样本进行分析。

氯化铯增加hiPSC-CM 自发动作电位的自发节律性，并抑制其起搏电流。其提示hiPSC-CM 可能具有不同于正常心室肌细胞的电生理特性。本研究亦为hiPSC-CM 的临床应用提供更为全面的基础理论。