信号素3A与足细胞形态及肾小球疾病的关系

王宝喜 ，贺松敏 ，王倩 ，张丹杰 ，江扬阳 ，宁莉

1.河北燕达医院检验科，河北廊坊 065300；2.天津医科大学第二医院检验科，天津 300000

信号素家族是调节细胞功能和形状的一种系统发育遗传保守蛋白。最初认为信号素在神经系统发育过程中发挥抑制作用，为轴突排斥蛋白，后来大量研究证实它具有调节心脏、肾脏、肺、骨骼和免疫发育的作用[1]。通过分析大量的文献，发现信号素在心血管疾病、癌症、骨质疏松症和免疫介导的疾病中都有调节作用[2]。已在卡尔曼氏（Kallman）综合征和先天性巨结肠（hirschprung）患者中检测到人Sema3A突变。信号素可分为膜结合蛋白、分泌蛋白或糖基磷脂酰肌醇连接蛋白。第3类信号素由7个分泌蛋白组成(Sema3A-3G)。在肾脏中几种3类信号素及其受体均有表达。有关学者研究了Sema3A和Sema3C在肾脏发育中的作用，并进一步证实了它们在肾小球发育和输尿管芽分枝形态发生中的重要性。该文主要对肾小球及足细胞疾病中Sema3A的作用进行了综述。

Sema3A是一种分泌型的导向蛋白，在中枢神经系统损伤(如脊髓损伤)部位的积累是结构和功能修复中起抑制作用，在心血管、肺和肾脏的形成等器官发生过程中起抑制作用[3]。Sema3A缺陷表示小鼠存在心脏和骨异常，以及肾小球内皮细胞过多，输尿管芽分支增多等肾脏血管结构的异常，提示Sema3A在肾发育过程中可抑制内皮细胞的迁移和限制输尿管芽的分支增多。相反，在发育过程中，强表达的获得型Sema3A会导致中枢神经系统损修复障碍，肾小球发育不良，足细胞分化延迟。Sema3A亦在正常成人肾脏足细胞和集合管中表达。Sema3A信号传导通过与神经纤毛蛋白-1（neuropilin1）和神经丛蛋白A1（plexin A1）的受体结合形成复合物介导的。已知这两种受体与信号蛋白(包括VEGFR 2、Fyn、Src和整合素)在细胞特异性环境中相互作用，进一步表明了Sema3A复杂的相关效应通路。神经素(neuropilins)是一种单通道跨膜蛋白，具有编码Sema3A和VEGF 165的大胞外结构域，跨膜结构域和短胞质尾。Sema3A与神经纤毛蛋白-1结合，组装全受体复合物并释放神经丛自身抑制因子。神经丛蛋白A-D包含9种保守的跨膜受体蛋白，其中Sema3A与神经丛蛋白A1结合。神经丛A下游信号转导复杂，涉及整合素和PI3K/Akt抑制，后者阻止GSK 3失活，激发与CRMPs的相互作用，从而对微管动力学具有强大的调节作用；并调节Fyn磷酸化，以及Rho、RAC GTP酶激活蛋白和酪氨酸单氧化酶微管相关蛋白（Mical），对肌动蛋白动力学和解聚分别产生作用[4]。

Sema3A与神经丛蛋白A1结合在肾脏足细胞、内皮细胞和输尿管芽衍生细胞中终身表达。神经丛蛋白A1也在同一细胞系的个体发育过程中表达。Sema3A可诱导足细胞膜蛋白（podocin）表达下调，从而降低去足细胞去氧肾上腺素、足细胞膜蛋白和CD2AP之间的相互作用。此外，过量的Sema3A会增加饥饿诱导的足细胞凋亡和在体内发育中肾脏的凋亡。

1 Sema3A强表达引起肾小球疾病

研究发现成年小鼠被人为大剂量注射Sema3A后，可引起类似硫酸鱼精蛋白引起的变化，表现为足突消失和蛋白尿，此病理改变具有短暂性和可逆性[5]。人为诱导成年小鼠足细胞中的Sema3A增强表达可导致蛋白尿，光镜下可见系膜基质扩张和轻度细胞增生，透射电镜(TEM)下可见肾小球滤过屏障3层明显异常。事实上，Sema3A过表达会引起肾小球内皮细胞肿胀和相互交错，肾小球基底膜(GBM)增厚和分层，以及足细胞足突明显消失。提示Sema3A过表达可诱导肾小球内皮细胞和足细胞损伤，破坏肾小球基底膜。值得注意的是，通过转变基因抑制Sema3A表达后，Sema3A诱导的白蛋白尿、足突消退、肾小球基底膜和内皮损伤出现逆转，这一改变进一步证实过量Sema3A表达与肾小球疾病的因果关系，并提示该途径可用于靶向治疗。

2 Sema3A功能增强下调去足细胞去氧肾上腺素

为进一步了解足细胞Sema3A过表达诱导小鼠肾小球疾病表型的分子基础，研究人员检测了足细胞裂孔隔膜和肾小球基底膜蛋白的表达情况。通过定量PCR、免疫组织化学和免疫印迹方法检测Sema3A诱导的成年肾脏肾小球基底膜表型的变化，包括MMP 9表达增加，胶原和层粘连蛋白链组成的细微变化。Sema3A过表达可引起可逆性的去足细胞去氧肾上腺素下调，而足细胞膜蛋白表达水平没有变化，表明去足细胞去氧肾上腺素表达下降非由于足细胞丢失所致[6]。通过WT1+核计数对每个肾小球切片中存在的足细胞数量进行计数也得到了证实。综上所述，足细胞足突消退、蛋白尿和去足细胞去氧肾上腺素的可逆性表达致病机制是在足细胞没有丢失的情况下，通过Sema3A过表达而引起：去足细胞去氧肾上腺素去表达破坏了足细胞裂孔隔膜完整，导致足突消失和肾小球滤过屏障通透性增加，见图1。

3 神经丛蛋白A1与去足细胞去氧肾上腺素相互作用

为了解Sema3A和去足细胞去氧肾上腺素信号相互作用的分子机制，研究人员分析了Sema3A信号受体神经丛蛋白A1和去足细胞去氧肾上腺素之间的关系，因为这两种蛋白都在足细胞膜上表达，并且经证实能形成多蛋白全受体复合物。值得注意的是，研究结果发现神经丛蛋白A1和去足细胞去氧肾上腺素在足细胞中同时存在，并有着物理联系。细胞转染和蛋白纯化实验证实了神经丛蛋白A1-去足细胞去氧肾上腺素的相互作用是直接的[7]。细胞外Sema3A信号与足细胞裂孔隔膜信号复合物之间有直接联系。Sema3A以一种自分泌的方式通过诱导足细胞收缩和F-肌动蛋白的崩解从而影响足细胞的形态。足细胞的大小、性状随诱导时间和剂量而减少而变化。

图1 Sema3A导致肾小球疾病致病机制Figure 1 Sema3A causes glomerular disease pathogenesis

过量的Sema3A与神经纤毛蛋白-1结合，导致神经丛蛋白A1活化后与去足细胞去氧肾上腺素相互作用，抑制细胞膜整合素，导致足细胞足突消失，内皮损伤和肾小球基底膜分层。虚线表示其他蛋白质相互作用。血管内皮生长因子-A敲除也抑制整合素活性，导致相似的表型。

2 Sema3A抑制肾小球αvβ3整合素活性并改变足细胞形态

大量研究表明，Sema3A信号转导会抑制整合素活性，从而负向调控内皮细胞的黏附和运动。整合素(α3,β1)及其相互作用的G蛋白(CD 151)可促使足细胞与肾小球基底膜粘附，是毛细血管循环和肾小球基底膜组装所必需的蛋白。检测Sema3A过表达是否影响αvβ3和β1整合素在成人肾脏中的表达和活性，能够进一步了解Sema3A浓度在肾脏疾病中的作用。肾小球内皮细胞和足细胞在代谢过程中均有表达αvβ3整合素，它们即是Sema3A旁分泌细胞和又是自分泌效应的靶细胞[8]。利用特异性整合素抗体或活性整合素抗体进行实验，发现若体Sema3A的功能增强后可降低约50%肾小球αvβ3整合素的表达和活性，αvβ3整合素活性降低有助于观察肾小球表型。值得注意的是，当敲除足细胞血管内皮生长因子-A基因后，出现类似的肾小球αvβ3整合素活性下降和肾小球表型。与Sma3A相似，血管内皮生长因子-A是肾小球发育和维持形态所必需的一种血管生成因子，由体内足细胞分泌。血管内皮生长因子-A和Sema3A以竞争的方式结合神经丛蛋白A1，神经丛蛋白A1作为血管内皮生长因子-A的共受体与Sema3A的受体结合。此外，神经丛蛋白A1、VEGF受体整合素2和3在足细胞和内皮细胞中相互作用。值得注意的是，以上现象发生在Sema3A过表达或血管内皮生长因子-A基因敲除情况下，表明足细胞分泌的这两种蛋白存在同一的信号通路或在独立通路合并后下调体内和培养细胞中整合素的活性[9]。综上所述，Sema3A过表达或VEGF基因敲除导致αvβ3整合素活性下降，破坏了肾小球滤过屏障的完整性和功能，除了动态和可逆(至少部分)之外，肾小球表型与整合素缺失模型相似，模拟了Sema3A或血管内皮生长因子-A调控表达的病理生理变化，见图1。

足细胞整合素活性下降可导致肾小球疾病，表现为局灶节段性肾小球硬化和肾病综合征，二者分别由过量suPAR过表达或自分泌的B7.1上调引β整合素的激活与失活。关于Sema3A诱导的αvβ3整合素活性降低与B7.1导致足突细胞消失的机制的相关性仍无可靠证据，后者的机制是与肌动蛋白结合蛋白破坏足细胞骨架形成。在人肾病综合征中关于Sema3A的作用及代谢关系有待确定。

目前，Sema3A基因在人体生理中的调控作用尚不清楚，大多数报道都集中在Sema3A的下游信号传导、发育和病理效应上。研究显示1型糖尿病小鼠模型中Sema3A蛋白升高，并观察到在晚期糖尿病肾病患者的肾活检中Sema3A蛋白表达升高(Veron&Tufro结果未公布)，提示Sema3A过表达可能参与到糖尿病肾病的发病机制中。有证据表明，Sema3A作为免疫应答的负调节因子具有保护骨和抗血管生成的作用，且提示Sema3A是治疗免疫疾病、骨质疏松和癌症的潜在靶点。有研究证实通过向肾细胞传递miR-199a-3p，下调Sema3A的表达，从而激活AKT和ERK通路，证明hBMSC-Exos具有抗凋亡作用，可以保护I/R免受损伤。这些发现揭示了hBMSC-Exos治疗AKI的新机制，为肾脏疾病的治疗提供了一种新的方法。miR-497-5p对semaphorin 3A表达具有高度抑制作用，semaphorin 3A和miR-497-5p均可被认为是未来治疗自身免疫性疾病(如多发性硬化症和类风湿关节炎)的治疗尝试的进一步研究的关键靶点[10-12]。因此，人们必须仔细研究Sema3A引起的肾小球疾病等非保护效应。

综上所述，Sema3A信号通路的精细调控对于维持成年小鼠的肾小球滤过屏障的结构和功能必不可少。事实上，足细胞Sema3A信号过表达导致肾小球疾病[11]。已证实Sema3A可诱导足细胞消失、破坏肾小球足细胞完整性，并引起内皮损伤的致病机制。即通过神经丛蛋白A1-去足细胞去氧肾上腺素的相互作用下调去足细胞去氧肾上腺素使F-肌动蛋白细胞骨架崩解，并降低肾小球足细胞和内皮细胞的αvβ3整合素活性。关于足细胞Sema3A信号转导的神经丛蛋白A1下游调控研究可为肾病和糖尿病肾病提供新的分子和细胞致病机制，以及新的治疗靶点。