旋毛虫肌幼虫ESPs作用于小细胞肺癌H446细胞蛋白组分变化分析

李美辰，潘靖丹，范泽华，陈万楼，陈彩铃，吴合亮，李天歌，孙亚杰，杜娈英

在中国，肺癌的发病率和死亡率呈现逐年上升趋势，对人类的健康和生命产生了巨大威胁[1]。根据全球肿瘤登记中心报告表明，肺癌发病率位居全国发病率首位，每年发病人数约为78.1万人。根据2018年全球癌症统计[2]，肺癌是最常见的癌症，是癌症死亡的主要原因。肺癌的病理类型分为小细胞肺癌和非小细胞肺癌。小细胞肺癌的恶性程度高于非小细胞肺癌，约占肺癌总数的14%左右[2]。旋毛虫(Trichinellaspiralis)是一种人兽共患寄生虫，据国内外研究发现，旋毛虫具有抑制肿瘤的作用。罗婧梅等[3]通过实验证明，旋毛虫肌幼虫排泄分泌蛋白(excretory-secretory proteins,ESPs)中含有抑制肿瘤生长的活性物质，把肌幼虫ESPs作用于小细胞肺癌H446后，能够抑制其增殖，并诱导H446细胞发生凋亡。本实验采用旋毛虫肌幼虫ESPs作用于小细胞肺癌H446细胞，通过质谱法分析细胞内蛋白组分的变化情况，进而观察ESPs抑制小细胞肺癌H446增殖的可能机制。

1 材料与方法

1.1实验动物、虫株及细胞株 7周龄，清洁级，雄性昆明小鼠，体重20～30 g，购自承德医学院动物实验中心。所用旋毛虫为实验室小鼠保种的猪源旋毛虫。小细胞肺癌H446细胞株购自广州吉妮欧生物科技有限公司。

1.2实验试剂 胃蛋白酶购自北京奥博星生物科技有限责任公司，氯化钠购自天津市百世化工有限公司，RPMI1640培养基购自赛默飞世尔(苏州)仪器有限公司，青链霉素购自武汉普诺赛生物科技有限公司。

1.3旋毛虫肌幼虫排泄分泌蛋白的获取 小鼠经口灌胃感染旋毛虫300条，35 d后采用颈椎离断法处死，取小鼠全部横纹肌置于搅拌机中粉碎，加入盐酸、胃蛋白酶，于37 ℃恒温水浴锅中消化3～4 h，通过改良贝氏法收集肌幼虫，除去肉渣和纤维，用含500 U/mL链霉素、青霉素的生理盐水洗涤沉淀数次，100目无菌铜网过滤、沉淀，收集获得纯净的肌幼虫。按4 000～5 000条的密度放置于含有青、链霉素的无血清的RPMI1640培养基中，在37 ℃，5% CO2的孵箱中培育24 h，选择培养基清澈，死虫率低的培养皿，10 000 r/min，4 ℃离心30 min，小心吸取上清，即获得干净的旋毛虫肌幼虫排泄分泌蛋白，采用BCA蛋白定量法测定蛋白浓度后保存于-80 ℃冰箱中备用。

1.4小细胞肺癌H446细胞的培养 取出本实验室液氮保存的小细胞肺癌H446细胞，置于37 ℃温水中缓慢融化，1 000 r/min，离心3 min后，弃掉冻存液，加入2 mL含有青链霉素和血清的RPMI1640培养基，混匀，加入培养皿中，补加至5 mL，37 ℃，5% CO2培养箱中培养。每天观察细胞形态，更换培养基，待细胞长到培养皿的85%～90%，即可进行细胞传代，经过3次传代后取处于对数生长期的细胞进行后续实验。

1.5细胞总蛋白提取及SDS-PAGE分离 将处于对数生长期的小细胞肺癌H446细胞传代至10 cm培养皿中，每日观察细胞状态，换液处理，待细胞长至85%～90%，把细胞分成实验组和阴性对照组。实验组加入0.85 mg/mL排泄分泌蛋白，对照组加入不含血清的RPMI1640培养基，分别作用24 h后，用PBS清洗细胞2次，用含0.25%胰酶消化细胞，收集细胞，按照细胞裂解液说明书，分别提取各皿中的细胞总蛋白，并进行蛋白浓度的测定。配制12%SDS-PAGE分离胶和5%SDS-PAGE浓缩胶，每孔上样80 μg，电压80V转至120 V进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离。凝胶用0.1%考马斯亮蓝R250染色液经过4 h染色后用乙醇-冰醋酸脱色液进行脱色。脱至背景无色透明(图1)。

1.6 质谱鉴定和分析

1.6.1脱色 沿染色边缘切下选定的含目的蛋白斑点的胶块，切成1 mm小胶粒，100 mL含50%乙腈，50 mmol/L碳酸氢铵溶液浸泡脱色，弃去溶液，重复1～2遍至胶粒无色。

1.6.2还原烷基化 加50 μL乙腈脱水至胶粒变白，真空离心10 min干燥胶粒。加入25 mmol/L碳酸氢铵(含10 mmol DTT)50 μL，56 ℃水浴1h。冷却至室温后，吸干并快速加入50 μL 25 mmol/L碳酸氢铵(含55 mmol/L碘乙酰胺)，置暗室45 min。再用乙腈脱水10 min至胶粒变白，真空抽干10 min。

1.6.3酶解 在干燥胶颗粒中根据胶粒大小加入2～5 μL 10 ng/μL胰蛋白酶(溶于25 mmol/L碳酸氢铵)，加入适量25 mmol/L碳酸氢铵溶液覆盖胶粒，37 ℃孵育过夜(16～18 h)。加入50 μL含0.1%甲酸和50%乙晴振荡摇匀，60 min后离心收集酶解液，加入50 μL 100%乙腈振荡摇匀，60 min后离心收集上清液，合并抽干，使用0.1% FA复溶用于后续液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)分析。1.6.4LC-MS/MS检测 液相色谱条件：色谱柱：Acclaim PePmap 100，C18富集柱(75 μm×20 mm，3 μm颗粒)；分析柱：自制一体柱，柱料：Venusil×BPC，C18(L)5 μm，150A(艾杰尔)(规格75 μm×150 mm，颗粒)。流速400 nL/min；流动相A：含0.1%甲酸水溶液；流动相B：含0.1%甲酸乙腈；质谱条件：离子化方式：纳升电喷雾正离子(ESI+)；数据采集模式：DDA方式，每次扫描中20个强度最高的离子进行串联质谱分析；离子源电压：1 800 V；毛细管温度：360 ℃；采集范围：MS 350～2 000 m/z，二级扫描范围依赖于一级母离子质荷比自动选择。

2 结 果

2.1质谱分析鉴定结果 质谱分析实验组共含有240种蛋白质，其中的204种为已明确鉴定的蛋白质，22种为未明确鉴定的蛋白质，14种为假定蛋白质。从已知的204种蛋白质中检索出1种与抗肿瘤相关的蛋白质即组蛋白H2A(histone H2A)。质谱分析对照组共含有233种蛋白质，其中195种为已明确鉴定的蛋白质，21种为未明确鉴定的蛋白质，17种为假定蛋白质。其中实验组和对照组的重合蛋白质为191种，实验组和对照组的非重合蛋白质为49种(表1)，对照组和实验组的非重合蛋白质为42种。240种蛋白均可以在Uniport网站上查询。

表1 ESPs组和对照组非重合蛋白

2.2蛋白功能富集分析 根据Gene Ontology 生物信息学分类，细胞组分分析发现，在实验组多于对照组的已鉴定的49种蛋白质中，属于细胞器组分的占59.2%(29/49)、属于细胞质组分的占51%(25/49)、属于细胞核组分的占32.7%(16/49)(表2)。

表2 已明确鉴定的蛋白质GO细胞组分、分子功能及生物过程分类

分子功能富集分析显示，这49种蛋白共具有142种分子功能，其中大部分参与结合、催化活性、核苷酸结合过程，还参与了DNA结合、水解酶活性等过程，所占比例较小的蛋白质参与了磷酸酶活化、连接酶活化等过程，如具有催化活性的占44.9 %(22/ 49)，参与核苷酸合成过程的占39%(19/49)，参与DNA结合过程的占10.2%(5/49)，参与磷酸酶活化过程的占4.1%(5/49)等。生物过程的分析结果表明，鉴定的蛋白质共参与了743种生物过程，大部分参与生物过程调节、多细胞生物发展过程，还参与了有机质代谢过程、细胞大分子代谢等过程，所占比例较小的蛋白参与了DNA 构象变化过程、凋亡过程、细胞通信调节等过程。

3 讨 论

旋毛虫是一种毛型科毛型种的寄生虫，其成虫寄生于哺乳动物肠道内，其幼虫寄生于横纹肌细胞内，是一种人兽共患的寄生虫[3]。为了适应其发育过程中不同的生活环境，旋毛虫虫体在不同发育阶段分泌不同的蛋白质，称为排泄分泌蛋白或排泄分泌抗原。流行病学调查和实验室研究证明旋毛虫对抑制肿瘤生长有积极或消极作用[4]。近年来国内外研究发现，旋毛虫的有效蛋白具有抑制肿瘤的作用，旋毛虫能够抑制肺癌[5]、白血病[6]、黑色素瘤[7]、肝癌[8]等恶性肿瘤。旋毛虫肌幼虫ESPs是通过提取旋毛虫肌幼虫，将其置于恒温培养箱中培养24小时吸取上清获得的。课题组常红敏[9]前期实验发现，旋毛虫肌幼虫ESPs能够抑制小细胞肺癌H446细胞的增殖，进一步研究旋毛虫肌幼虫ESPs能够诱导H446细胞发生凋亡，后期研究发现，旋毛虫肌幼虫ESPs能够触发线粒体凋亡通路诱导H446细胞发生凋亡，然而，ESPs是一种复杂的混合物，到底是哪些蛋白起了抑制肿瘤细胞的增殖作用以及作用的可能机制并不明确。因此，我们进行了此项实验，把旋毛虫肌幼虫ESPs作用于H446细胞，与对照组相比，通过质谱法观察细胞组分的变化。LC-MS/MS是一种准确度高，分离范围广的快速分离方法，它对化合物的结构破坏性小，适合有机分子和生物分子的分离。质谱具有其他分析方法无可比拟的灵敏度，对于未知化合物的结构分析定性十分准确，对相应的标准样品要求也比较低。

本文用LC-MS/MS质谱法分析了旋毛虫肌幼虫ESPs作用于小细胞肺癌H446细胞的全部蛋白的组分。和对照组比较，实验组多出蛋白组分49种，对这49种蛋白质进行GO分析，发现这49种蛋白具有催化活性等142种分子功能，参与代谢过程、胚胎发育、应激反应、生物调节等743种生物过程(表2)。课题组Luo JM等[10]运用LC-MS/MS技术发现旋毛虫肌幼虫ESPs中有6种与抗肿瘤相关的蛋白质。但旋毛虫肌幼虫ESPs作用于H446细胞后，从实验组细胞中只鉴定出H2A一种。推断组蛋白H2A可能通过某种方式进入了细胞里，对于旋毛虫肌幼虫ESPs抗肿瘤发挥了重要作用。

组蛋白是由H2A、H2B、H3、H4构成的组蛋白八聚体，位于真核细胞染色体基本单位—核小体中[11]。王蓓莉等[12]对讨论核心组蛋白H2A在乳腺癌组织中的表达以及乳腺癌患者预后生物因素进行分析，发现TNM分期越早，H2A表达越高，低表达的H2A常提示TNM分期晚，H2A的低表达提示更低的生存率，可能提示H2A有抑制肿瘤的作用。Mir AR等[13]发现，糖氧化修饰组蛋白H2A与其他糖化蛋白和核酸产生交叉反应，在癌症患者中形成了高特异性抗体，可能提示H2A有抑制癌症的作用。王蓓莉等[11]研究发现H2AX是组蛋白H2A的一种变体，被认为是一种新的抑癌蛋白。 Balicki D等[14]发现瞬时转染了组蛋白H2A的scIL-12 细胞因子能有效诱导抗肿瘤免疫反应。

实验组和对照组的重合蛋白质为191种，非重合蛋白质分别有49种和42种，说明旋毛虫肌幼虫ESPs作用于H446细胞后，除去检出抗肿瘤成分H2A外，细胞内蛋白组分也发生了明显而复杂的变化，作者推测旋毛虫肌幼虫ESPs抗肿瘤不是H2A单独作用的结果，可能是多种物质综合作用的结果，作用过程复杂。

利益冲突：无