五种植物粗多糖诱导小鼠骨髓来源树突状细胞成熟的体外筛选

董晓筱，李博野，张季瑶，陈 颖，胡 秦*，彭 博*

(1.北京工业大学生命科学与生物工程学院，北京 100124； 2.北京工业大学环境与能源工程学院， 北京 100124； 3.中国中医科学院中药研究所，北京 100124)

树突状细胞(dendritic cells, DC) 由造血干细胞分化，经历前体细胞、未成熟树突状细胞和成熟树突状细胞三个阶段。机体内的DC分布较为广泛，常定居于脾、淋巴结、表皮等部位[1]。作为哺乳动物的一种抗原提呈细胞(antigen presenting cell, APC)，DC不仅具有摄取、加工、处理及呈递抗原的能力，同时也可释放多种细胞因子，提呈抗原并激活初始T细胞，进一步启动T细胞免疫反应[2]，因而在机体固有免疫和适应性免疫应答中均起着重要的作用。近年来，人们已经可以通过使用多种细胞因子，如GM-CSF、IL-4、Flt3等[3]方法来诱导骨髓细胞体外定向分化为骨髓来源的树突状细胞(BMDC)，BMDC的体外培养和成熟活化实验已被广泛应用于佐剂筛选、免疫激活等相关研究中。

多糖是植物体内的一类重要化学物质，不仅在植物体内含量较高，而且还具有丰富的生物学功能。目前，对于植物多糖的研究主要包括免疫调节、抗肿瘤、抗氧化等方面[4-5]。植物多糖具有安全性较高、天然可降解性、免疫原性低、毒副作用小等优点。本文选用了灵芝多糖、枸杞多糖、香菇多糖、黄芪多糖、云芝多糖五种粗多糖分别检测了它们对于BMDC的体外诱导成熟作用。

1 材料和方法

1.1 实验动物

SPF级C57BL/6雌性小鼠21只，6～8周龄，20～22 g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司[SCXK(京)2016-0006]，实验动物饲养于中国中医科学院基础理论研究所[SYXK(京)2016-0021]，严格按照中国中医科学院中国中医科学院中医基础理论研究所伦理要求进行动物实验(20190901058)，在实验研究过程中遵守“3R”原则，并给予实验小鼠应有的人道关怀。

1.2 主要试剂

灵芝提取物(生产批号: BCSW20180228-8)；香菇提取物(生产批号: BCSW20180228-8)；枸杞提取物(生产批号: BCSW20180228-8)；云芝提取物(生产批号：BCSW20180228-8)购于西安天象生物工程有限公司，采用热水浸提、醇沉和酶解工艺进行粗多糖的提取，多糖含量均在50%以上；注射用黄芪多糖购自伯恩公司(生产批号: 151101)。CpG 1668 ODN (5’-tccatgacgttcctgatgct-3’)由生工生物工程公司合成；RPMI1640细胞培养基、胎牛血清(FBS)均购自Gibco公司；GM-CSF、IL-4购于PeproTech公司；流式抗体APC anti-mouse CD80、PerCp/Cy 5.5 anti-mouse CD40、PE anti-mouse I-A/I-E、FITC anti-mouse CD11c、anti-mouse CD16/32、小鼠IL-6、IL-12p40和TFN-α试剂盒均购自BioLegend公司。

1.3 实验方法

1.3.1 植物粗多糖溶液制备

使用无内毒素的水分别溶解枸杞、灵芝、香菇、黄芪和云芝的粗多糖粉末，并调整浓度为10 mg/mL，通过内毒素清除柱(Thermo Scientific)处理后，经ToxinSensor终点显色法内毒素检测试剂盒(Genscript)检测，内毒素含量均在0.05 EU/mL以下。多糖溶液经0.22 μm滤膜过滤后，保存于-20℃下备用。

1.3.2 小鼠BMDC细胞培养

取C57BL/6小鼠脱臼处死，无菌分离股骨，经RPMI1640培养基反复冲洗骨髓，1000 r/min离心后重悬于RPMI1640培养基中。细胞悬液以1×106/mL密度接种于6孔板中，加入含GM-CSF(20 ng/mL)的完全培养基(RPMI1640培养基含10%灭活胎牛血清，双抗及50 μmol/L β-巯基乙醇(SIGMA)。每2 d对细胞进行换液。培养6 d后，收集悬浮或松散贴壁细胞(未成熟BMDC)用于后续实验。

1.3.3 流式细胞仪测定细胞表面CD80，CD86和MHCII的表达

未成熟BMDC细胞使用RPMI1640培养基调整细胞浓度为1×106/mL，接种于24孔板中，分别加入枸杞粗多糖、灵芝粗多糖、香菇粗多糖、黄芪粗多糖和云芝粗多糖，终浓度为100 μg/mL。阴性对照组加入不含药物的RPMI1640培养基，阳性对照组加入终浓度为4 μg/mL的CpG 1668 ODN。37°C，80% 湿度，5% CO2条件下培养24 h后，1000 r/min离心5 min，收集细胞，经anti-mouse CD16/32封闭抗体封闭，冰浴10 min后，加入APC-CD80、Percp/cy 5.5-CD86、PE-MHC II、FITC-CD11c四种抗体于4℃ 避光染色30～40 min。收集细胞，采用BD FACSCalibur流式细胞仪进行检测，通过Flowjo v10软件分析细胞表面分子表达。

1.3.4 酶联免疫吸附法测定IL-6，IL-12p40和TFN-α

未成熟BMDC细胞以1×106/mL密度接种于96孔板中，采用不同的粗多糖刺激24 h后，收集细胞培养上清，分别采用小鼠IL-12p40， IL-6和TFN-α检测试剂盒进行检测。采用酶标仪(PerkinElmer)测定450 nm下的吸光值(OD值)，并根据标准曲线计算样品中的细胞因子含量。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 植物粗多糖对BMDC细胞表面分子标志表达的影响

采用流式细胞仪检测粗多糖对BMDC细胞表面CD80和CD86表达的影响，结果发现与阴性对照组(CC组)相比，阳性对照CpG ODN显著提高BMDC细胞表面CD80, CD86和MHCII (I-Ab)表达。云芝粗多糖显著上调CD86和MHCII (I-Ab)表达，对CD80有一定上调作用，但无显著性差异。黄芪粗多糖，枸杞粗多糖，灵芝粗多糖和香菇粗多糖均无明显作用(如图1)。结果表明云芝粗多糖可显著上调BMDC细胞表面细胞成熟相关分子的表达，具有诱导BMDC细胞成熟的作用。

2.2 植物粗多糖对BMDC细胞分泌细胞因子的影响

采用ELISA试剂盒检测五种植物粗多糖对BMDC细胞培养上清中IL-6，IL-12p40和TFN-α细胞因子的释放影响。结果发现，与阴性对照组(CC组)相比，云芝粗多糖培养组和CpG ODN阳性对照组均显著提升BMDC细胞培养上清中IL-6(P<0.001)，IL-12p40(P<0.05)以及和TFN-α(P<0.001)的含量。枸杞粗多糖(P<0.05)，灵芝粗多糖(P<0.001)和香菇粗多糖(P<0.05)组，BMDC细胞培养上清中IL-6的释放显著性提高。其余组均可见不同程度的IL-6，IL-12p40和TFN-α表达上调，但与对照组相比，无显著性差异(如图2所示)。因此，云芝粗多糖可显著刺激BMDC细胞释放IL-6，IL-12p40和TFN-α，枸杞粗多糖，灵芝粗多糖和香粗菇多糖可刺激BMDC细胞释放IL-6。

3 讨论

近年来，随着植物粗多糖药理学方面的研究应用逐渐深入，植物多糖作为植物中极为重要的成分，其预防或治疗疾病的功能也受到了重视，主要活性包括抗肿瘤、抗病毒、降血脂血糖、抗氧化等[6]，已有文献证明枸杞多糖、灵芝多糖、香菇多糖、黄芪多糖等都具有增强机体免疫能力，促进炎症因子表达，抗病毒、降血糖、诱导体液和细胞免疫应答等功能，例如黄芪多糖已被用于口蹄疫疫苗、狂犬病疫苗、新城疫疫苗等疫苗佐剂[7]；云芝多糖可增强NK细胞的杀伤功能，促进小鼠T淋巴细胞和B淋巴细胞增值，增强肿瘤坏死因子吞噬能力[8-9]；香菇多糖具有抗氧化作用，可以抑制苯并芘诱导产生的氧化应激反应，降低皮肤癌风险[10]，可对糖尿病大鼠的脑组织起到保护作用[11]；灵芝多糖可激活T淋巴细胞、B淋巴细胞及巨噬细胞等，促进细胞因子分泌，提高机体的免疫功能[12]。本实验主要对比了灵芝、香菇、枸杞、黄芪、云芝几种粗多糖对于BMDC细胞的体外诱导成熟作用，进一步研究其作为佐剂的潜力。

注：A: 五种粗多糖对BMDC细胞表面标志物表达的影响；B: CD80的表达；C: CD86的表达；D: I-Ab的表达。与阴性对照组相比，**P<0.01，***P<0.001。图1 植物多糖对BMDC细胞表面标志分子表达的影响Note. A, Effects of five polysaccharides on BMDC surface marker expression. B, CD80 expression on BMDCs. C, CD86 expression on BMDCs. D, I-Ab expression on BMDCs.**P<0.01,***P<0.001.Figure 1 Effects of plant polysaccharides on BMDC surface marker expression

注：A: IL-6的释放情况；B: IL-12p40的释放情况；C: TFN-α的释放情况。与阴性对照组相比，*P<0.01，***P<0.01。图2 植物粗多糖对BMDC细胞释放细胞因子的影响Note. A, Secretion of IL-6. B, Secretion of IL-12p40. C, Secretion of TFN-α. Compared with the CC group, *P<0.01,***P<0.01.Figure 2 Effects of plant polysaccharides on cytokines released by BMDC

DC作为机体内最为重要的一种APC，是机体固有免疫的参与者，更是机体适应性免疫应答反应的启动者[13]。未成熟的树突状细胞可以通过多种模式识别受体，如Toll样受体(toll-like receptors, TLR)感知抗原，进一步成熟，成熟DC的表面共刺激分子、分泌因子与趋化因子增多[14-15]，除通过MHC-II类分子提成抗原激活CD4+T细胞外，DC还可以通过MHC-I途径激活CD8+T细胞[16]，更高效全面的发挥树突状细胞的免疫调节功能，因此，DC的活化及数量都关系着免疫系统的功能。随着对DC的研究发展，发现其在过敏反应[17]、感染性休克[18]、抗肿瘤[19]、疫苗佐剂研究等方面都起着至关重要的作用，已有文献证明，大多数肿瘤组织中的DC处于未成熟状态，肿瘤细胞诱导DC凋亡，并通过分泌细胞因子抑制DC的产生和成熟[20]，因此，DC的成熟对机体的免疫反应起着重要的作用，对DC的诱导成熟也是研究疫苗佐剂的切入点。

本文中以CpG ODN做为阳性对照，使用五种不同的植物粗多糖对BMDC细胞进行体外培养，通过流式细胞术检测BMDC细胞表面标志分子CD80，CD86和MHCII的表达量的变化及ELISA检测BMDC细胞上清中IL-6，IL-12p40和TFN-α的含量。实验结果表示，云芝粗多糖与BMDC细胞共培养24 h后，细胞表面CD80，CD86和MHCII的表达量均有上调，BMDC细胞分泌的IL-6，IL-12p40和TFN-α均有提升。综上所述，初步分析云芝粗多糖具有诱导BMDC细胞成熟的能力，因此也具有疫苗佐剂的潜在应用可能性，值得进一步研究。