DIS3对人骨髓瘤细胞周期及肿瘤相关蛋白表达的影响研究

邹 亮，程 辉，张 婷，周 英，关 军，程 平，王兰兰

(武汉市第一医院血液内科，武汉 430022)

多发性骨髓瘤(multiple myeloma, MM)是一种浆细胞恶性增殖性疾病，以骨髓内恶性浆细胞的克隆增生为其主要特征[1]。目前，针对多发性骨髓瘤的治疗手段虽多，且均能延长了患者的生存时间，但由于各种各样的并发症，导致患者的生存质量较差，因此，寻求新的治疗方法迫在眉睫[2-3]。研究发现，几乎所有肿瘤细胞均存在细胞周期异常；因此，肿瘤也被称为细胞周期病。肿瘤细胞最明显的特征为不依赖于细胞外生长信号的刺激而能反复自发的进行细胞周期循环，细胞增殖增加、凋亡细胞减少，最终诱发细胞不可控的异常增殖而导致肿瘤形成[4]。全基因组测序结果显示，DIS3基因具有较强的突变特性，DIS3基因突变是导致MM发生的原因之一[5]，但其对骨髓瘤细胞的周期变化及具体作用机制尚不明确。细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases, ERK)ERK1/2，是将信号传导的关键因子，磷酸化的ERK1/2由胞质转位到核内，介导ATF，Ap-1，c-fos和c-Jun等因子的活化，参与细胞增殖、分化、凋亡，维持细胞稳态等多种生物学反应[6-7]。

本实验中，我们通过构建DIS3过表达或干扰载体，观察过表达或干扰DIS3对细胞周期及肿瘤相关蛋白的表达影响，旨在为临床治疗MM提供潜在的策略。

1 材料和方法

1.1 实验细胞

人骨髓瘤细胞株NCI-H929(货号：CRL-9068)、RPMI 8226(货号：CCL-155)和U266(货号：TIB-196)购自ATCC。

1.2 主要试剂与仪器

人RPMI-1640细胞培养基、胎牛血清、青-链霉素双抗及Lipofectamine 2000均购于美国Invitrogen生命技术公司；真核表达载体PEGFP-N1由武汉华联科生物技术有限公司分子实验室保存并提供；细胞RNA提取试剂盒、反转录试剂盒购自宝日医生物技术(北京)有限公司；SYBR Green染料购自Lumiprobe Corporation公司；CycletestTMPlus DNA Reagent Kit(细胞周期检测)购自BD Biosciences；蛋白提取试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司；一抗：Cyclin B1(货号：ab2949)、P21(货号：ab109199)、CDK2(货号：ab32147)、MYC(货号：ab32072)、RAS(货号：ab52939)、TP53(货号：ab131442)、BRAF(货号：ab167415)、p-ERK1/2(货号：ab201015)、GAPDH(货号：ab9485)以及山羊抗兔二抗IgG(货号：ab6734)购自美国Abcam公司；主要仪器：CO2培养箱(Thermo，美国)；倒置显微镜(Nikon，日本)；实时荧光定量PCR仪(Bio-RAD，美国)；离心机(Eppendorf，德国)；流式细胞仪(Beckman，美国)。

1.3 实验方法

1.3.1 细胞的复苏、培养及转染

人骨髓瘤细胞NCI-H929、RPMI 8226和U266分别培养于含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基中，培养至对数期时，按照前期本课题组相应转染方案[8]进行转染，转染48 h后收集细胞进行转染效率检测。

1.3.2 PI单染法检测细胞周期变化

3种细胞均分成5组：对照组、DIS3-siRNA阴性对照(NC)组、DIS3-过表达空载组、DIS3-过表达组、DIS3-siRNA组。按每孔104个细胞进行接种，每孔加100 μL细胞培养液后，置于5% CO2的恒温培养箱进行培养。48 h后收集各组细胞，混匀后转移至流式专用管中；离心弃上清沉淀后，用无水乙醇于-20℃冰箱内固定细胞24 h，分别加入RNase A和碘化丙啶(propidium iodide，PI)溶液，避光染核10 min。用流式细胞仪进行检测。

1.3.3 qRT-PCR检测各指标的mRNA表达水平

根据NCBI上公布的各基因序列分别设计qRT-PCR用引物(表1)，并由上海生工代为合成。48 h后收集各组细胞，分别提取各组细胞样本RNA，反转录，扩增后，以GAPDH为内参基因，以2-△△CT计算各基因的相对表达量。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.3.4 Western blot

48 h后收集各组细胞，采用BCA蛋白浓度检测试剂盒对所提蛋白进行浓度检测；上样、电泳、封闭后，分别加入兔抗人一抗(Cyclin B1，1∶500、P21， 1∶1000、CDK2，1∶500、MYC，1∶500、RAS，1∶500、TP53，1∶800、BRAF，1∶1000、p-ERK1/2，1∶1000和GAPDH，1∶2000)，4℃过夜；加入相应的二抗IgG(羊抗兔，1∶5000)，室温孵育30 min后，以GAPDH为内参蛋白，采用Quantity One图像分析软件进行灰度比分析。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 DIS3过表达或干扰对细胞周期的影响

3种细胞的细胞周期变化检测结果显示(图1)，与空载体组比较，DIS3过表达组细胞发生了明显G0/G1期阻滞现象，表现为G0/G1期细胞占比显著增加(P<0.01)；与NC组比较，DIS3-siRNA明显促进了细胞周期进程，表现为G0/G1期细胞占比的显著降低(P<0.05，P<0.01)。

2.2 DIS3过表达或干扰对细胞周期相关指标Cyclin B1、P21、CDK2表达的影响

3种细胞的细胞周期相关基因Cyclin B1、P21、CDK2表达检测结果显示(图2A)，与空载体组比较，DIS3过表达组Cyclin B1、CDK2表达水平显著降低(P<0.05)，P21表达水平显著升高(P<0.01)；与NC组比较，DIS3-siRNA明显促进了Cyclin B1、CDK2的表达而抑制了P21的表达(P<0.01)。而三指标在蛋白水平上的表达与mRNA水平表达趋势基本一致(图2B)。

2.3 DIS3过表达或干扰对肿瘤相关指标MYC、RAS、TP53及BRAF表达的影响

3种细胞的肿瘤相关基因MYC、RAS、TP53及BRAF表达检测结果显示(图3A)，与空载体组比较，DIS3过表达组MYC、RAS、TP53及BRAF表达水平显著降低(P<0.05，P<0.01)；与NC组比较，DIS3-siRNA明显促进了MYC、RAS、TP53及BRAF的表达(P<0.01)。MYC、RAS、TP53及BRAF在蛋白水平上的表达与mRNA水平表达趋势基本一致(图3B)。

2.4 DIS3过表达或干扰对ERK1/2信号通路的影响

3种细胞的ERK1/2信号通路活化检测结果显示(图4)，与空载体组比较，DIS3过表达能显著抑制ERK1/2信号通路的激活，表现在p-ERK1/2的表达明显降低(P<0.05)；与NC组相比，DIS3沉默则显著增加了ERK1/2信号通路的活性，表现为p-ERK1/2的表达显著升高(P<0.05)。

3 讨论

注：与空载组比较，**P<0.01；与NC组比较，#P<0.05，##P<0.01。图1 流式细胞术检测细胞周期变化Note. Compared with the empty vector group,**P<0.01. Compared with the NC group,#P<0.05，##P<0.01.Figure 1 Cell cycle changes were detected by flow cytometry

注：A：各指标mRNA水平的表达；B：各指标蛋白水平的表达；与空载组比较，*P<0.05，**P<0.01；与NC组比较，#P<0.05，##P<0.01。图2 细胞周期相关指标Cyclin B1、P21、CDK2的表达变化Note. A, mRNA expression. B, Protein expression. Compared with the empty vector group,**P<0.01. Compared with the NC group,#P<0.05,##P<0.01.Figure 2 Changes in the expression of cell cycle-related indicators Cyclin B1, P21 and CDK2

注：A：各指标mRNA水平的表达；B：各指标蛋白水平的表达；与空载组比较，*P<0.05，**P<0.01；与NC组比较，#P<0.05，##P<0.01。图3 肿瘤相关指标MYC、RAS、TP53及BRAF的表达变化Note. A, mRNA expression. B, Protein expression. Compared with the empty vector group,*P<0.05,**P<0.01. Compared with the NC group,#P<0.05，##P<0.01.Figure 3 Changes in the expression of tumor-related indicators MYC, RAS, TP53 and BRAF

注：与空载组比较，*P<0.05；与NC组比较，#P<0.05。图4 p-ERK1/2的表达变化Note. Compared with the empty vector group,*P<0.05. Compared with the NC group,#P<0.05.Figure 4 Changes of p-ERK1/2 expression

生理条件下，细胞的增殖与凋亡处于动态平衡中，细胞周期的异常会导致细胞增殖与凋亡的失衡，是诱发肿瘤发生的关键环节[9]。多发性骨髓瘤(MM)主要表现为恶性浆细胞无节制地增生、广泛浸润和大量单克隆免疫球蛋白的出现及沉积导致正常多克隆浆细胞增生和多克隆免疫球蛋白分泌受到抑制，从而出现临床上的异质性症状及相应并发症[10]。DIS3是一种新型的MM抑制基因，其编码蛋白DIS3能够对所有的RNA进行修饰[11-12]。相关临床研究发现，DIS3突变的MM患者总体中位生存期大大缩短[12-13]。因此，研究DIS3的表达调控对MM细胞周期的影响具有重要的意义。在本实验中，DIS3过表达能显著抑制3种人骨髓瘤细胞的周期进程，表现为显著的G0/G1期细胞阻滞、细胞周期调控蛋白Cyclin B1、CDK2的表达减少及P21的表达升高。反之，通过siRNA技术抑制DIS3的表达则从一定程度上促进了癌细胞的周期进程，表现为G0/G1期细胞占比减少、细胞周期调控蛋白Cyclin B1、CDK2的表达增加、P21表达减少，提示对DIS3进行表达调控能显著影响骨髓瘤细胞的细胞周期进程。在以果蝇为研究对象的实验中发现，DIS3的缺失会抑制细胞的有丝分裂，进而导致幼虫的生长阻滞及某些组织器官的发育减缓，提示DIS3的外切酶功能对于细胞有丝分裂是不可或缺的，DIS3的异常会导致细胞的有丝分裂的延迟，表现出非整倍性和过浓缩的染色体[14]。DIS3是结肠癌的新型候选癌基因，沉默DIS3可影响结肠癌细胞的生物学行为[15]。因此，恢复DIS3的表达水平进而维持其功能的稳定性对骨髓瘤细胞的恶性增殖可能具有抑制作用，在本实验中，我们发现DIS3的抑制作用可能与改变骨髓瘤细胞的细胞周期进程密切相关。此外，我们还发现DIS3过表达抑制了3种骨髓瘤细胞中癌基因MYC、RAS、TP53及BRAF蛋白水平的表达，提示癌细胞潜在的恶性生物学特征得到了抑制。细胞外调节蛋白激酶1/2(ERK1/2)信号转导通路是丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)成员之一[16]。在细胞增殖、分裂、凋亡及恶性转化等过程中均具有重要的作用，尤其在多种癌细胞中，ERK1/2常处于异常高表达或激活状态，且被认为是多种药物的潜在作用靶点[17-19]。例如，在胆囊癌细胞中，青蒿素抑制细胞增殖、抑制CDK4和Cyclin D1表达以及诱导p16表达所造成的细胞G1期阻滞被认为与ERK1/2信号转导通路的抑制相关[20]。在乳腺癌的体外实验中发现，厄贝沙坦影响MCF-7细胞的周期，使得细胞的G0/G1期细胞比例增多，而S期细胞比例下降，进而抑制细胞的生长，这一作用被证明与p-ERK1/2蛋白的表达下调有关[21]。而作为抗肿瘤的化疗药物，卡铂主要通过诱导细胞周期阻滞抑制肿瘤细胞生长，其对卵巢癌HO-8910细胞作用研究表明，其通过抑制ERK1/2激活，诱导细胞S和G1期阻滞，进而抑制细胞生长[22]。而本研究中，我们同样发现，DIS3过表达同样抑制了ERK1/2的激活，而DIS3沉默促进了ERK1/2的活化。

综上所述，过表达DIS3能通过抑制ERK1/2通路的活性进而抑制骨髓瘤细胞的细胞周期，降低癌基因的表达水平。后期我们将在体内水平进行进一步研究，以期为临床治疗MM提供潜在的靶点。