钙化性主动脉瓣膜病小鼠模型比较及应用研究进展

宗永辉，刘新灿

(1.河南中医药大学,郑州 450000； 2.河南中医药大学第一附属医院,郑州 450000)

钙化性主动脉瓣膜病(calcific aortic valve disease, CAVD)是指由早期未发生血液动力学影响的瓣膜硬化逐渐发展到需要瓣膜置换术的严重钙化性主动脉瓣狭窄(aortic valve stenosis,AS)的进展性疾病[1]，其主要特征为炎症，纤维化和钙化[2]。在发达国家，钙化主动脉瓣疾病是成年人主动脉瓣狭窄最常见的病因，并且患病率随着年龄的增加呈非线性增长[3]。我国一项针对老年瓣膜性心脏病住院患者诊疗状况的研究结果显示，钙化性主动脉狭窄患者占比18.99%[4]。随着医疗卫生条件的提升以及人口老龄化的显著，钙化性主动脉瓣膜病的发病率将逐年上升。目前对钙化性主动脉瓣狭窄的药物治疗未显示出可减轻进行性瓣膜钙化或改善生存率，症状严重者主要通过外科手术和内科介入干预[5]。所以明确钙化性瓣膜病的发病机制，进行早期干预，延缓发病进程，是现在社会面临的重大课题。

对瓣膜病的的发病机制的认识从以往的随着年龄增长的被动性退化现象转变为主动性的类似“动脉粥样硬化”病变[2]，这一里程碑式的研究重新引起了对钙化性瓣膜病研究的热潮。根据临床上对疾病发病机制的认识，再转移到动物实验给与验证，是我们研究钙化性瓣膜病的主要方法。在实验研究中，虽然体外实验可以观察到对细胞因子的影响，但无法发观察到病理生理学的代偿反应；并且瓣膜所处解剖位置和环境的特殊性和复杂性，因此整体动物实验更能合适对瓣膜病机制的研究[6]。目前动物造模方法较多[7-8]，使用的动物也不相同，如小鼠、兔、猪等。其中最常用的是小鼠模型，首先是它们的体型小，便于饲养和管理，并且具有经济成本低等优势；其次是较短的繁殖周期、遗传操作的简便性以及基因图谱的全面性使得对CAVD的关键分子介体的具体研究成为可能。本文主要针对钙化性主动脉瓣狭窄的模型优缺点及进展现进行综述，总结见表1。

1 饮食诱导模型

1.1 高胆固醇饮食法

临床证据表明，冠状动脉粥样硬化和主动脉瓣狭窄具有相似的流行病学危险因素，例如年龄，性别，高胆固醇血症和高血压[9-11]。对人类狭窄主动脉瓣的临床病理研究发现，病变与包含炎性细胞和钙化沉积物的动脉粥样硬化斑块相似[12-13]。临床前研究进一步证实了在兔和小鼠动脉粥样硬化模型中主动脉瓣小叶中的动脉粥样硬化样病变[14-15]。因此，动脉粥样硬化模型常被借鉴到主动脉瓣狭窄的实验研究。

标准饮食条件下野生型小鼠(WT)不会自发主动脉瓣钙化，因此需要高脂饮食或者基因敲除等方式干预。低密度脂蛋白受体 (LDLR) 是肝细胞膜上一种镶嵌式蛋白，能介导LDL和VLDL的胞吞作用，低密度脂蛋白受体缺陷(LDLr-/-)小鼠可引起内源性胆固醇升高常被应用于钙化性瓣膜病模型的建立。C57BL/6J背景的低密度脂蛋白受体缺陷(LDLr-/-)雄性小鼠常规饮食17～22个月时，会自发出现轻度高胆固醇血症、瓣口直径急剧缩小、跨瓣膜收缩压梯度升高以及左心室肥厚等早期瓣膜硬化表现[16]。Towler等[17]应用特制饮食中脂肪含量为总热量的42%并含有0.15%胆固醇和0.5%的胆酸盐的饲料喂食17周后，出现严重的胆固醇血症(1040±37)，高血糖和瓣膜矿物质沉积以及骨桥蛋白(osteopontin，OPN)的表达。

载脂蛋白E(ApoE)是VLDL受体的配体，也是肝细胞CM残粒受体的配体，载脂蛋白E缺陷(apoE-/-)同样引起内源性胆固醇升高。在没有饮食干预条件下，半数以上的apoE-/-小鼠在超过43周龄时主动脉流速快于150 cm/s，最高可达427 cm/s，其中伴有少数主动脉反流，并且与性别无相关性；Von Kossa染色在97周龄主动脉瓣中显示出异位钙化[15]，这与人主动脉瓣狭窄病程相似。在apoE-/-小鼠10周龄时给予脂肪含量为总热量的42%并含有0.2%胆固醇的饮食，30周龄时血清胆固醇明显增加至588 mg/dL，小叶增厚，内皮细胞活化，以及富含巨噬细胞的内皮下病变；在病变区域能够检测到组织蛋白酶B，α平滑肌肌动蛋白(αSMA)，碱性磷酸酶，Runx2和OPN mRNA表达[18]，虽然没有von Kossa染色的证据表明有钙盐沉积，但通过双膦酸盐结合的成像颗粒显示出早期微钙化的迹象，表明该饮食模式可导致加速早期疾病形成。

模型评价：该模型优点是操作简单，明显的缺陷是在单纯饮食干预下造模周期较长，模型成功率低；联合基因敲除虽然能够明显缩短主动脉狭窄模型的建立时间，但不可避免的出现严重的高胆固醇血症，导致小鼠过早死亡，并且这与人瓣膜病发病时轻度高胆固醇血症不符。以往临床研究表明他汀类药物对主动脉瓣狭窄没有明显的疗效[19-22]，动物实验研究表明在早期进行他汀药物的干预可延缓疾病的进展[14,23]。因此，该模型可适用于明确高胆固醇血症在主动脉瓣膜狭窄进展中的作用以及他汀类药物对瓣膜病的影响研究。

1.2 高脂饮食法

许多研究表明以胰岛素抵抗/2型糖尿病(T2D)为特征的代谢异常状态在CAVD的发生和进展中起重要作用[24-25]。Towler等[17]在一项关于糖尿病对血管钙化的研究中，低密度脂蛋白受体缺陷(LDLr-/-)小鼠给予总热量的 58%来自脂肪而没有添加胆固醇的食物，喂食2周后胆固醇出现明显变化，17周后血清胆固醇水平较正常饮食组升高62%，并出现高血糖，高胰岛素血症和肥胖症，von Kossa染色发现主动脉瓣小叶上矿物质沉积。Drolet等[26]采用同样的喂养模式喂食C57BL/6J背景的雄性小鼠，4个月后出现轻度高胆固醇血症，肥胖和高血糖症；超声心动图检测主动脉瓣面积(aortic valve area，AVA)减小，跨瓣速度增加，瓣膜小叶增厚；免疫组化检测证实巨噬细胞(CD68阳性细胞)，泡沫细胞等炎性细胞以及骨桥蛋白的合成；组织染色发现瓣膜小叶区域有结节性钙沉积，再次证实了CAVD的病因是多因素的。

模型评价：高脂饮食模型明显的优点是避免了高胆固醇饮食引起的高胆固醇毒症，同时引起的体重增加和血糖的升高近似模拟了人类真实生活环境中，这与钙化性瓣膜病流行病学危险因素[27]相一致。Le等[28]利用合并血脂异常和2型糖尿病的LDLr-/-/ApoB100/100/IGF-II小鼠模型，观察到高胆固醇血症和高血糖症对CAVD早期病变的累积效应，证实了T2D是CAVD发生发展的独立危险因素，可能成为未来潜在的治疗靶点。因此，该模型可应用于研究血糖对瓣膜病钙化形成的影响以及降糖药物延缓病情进展的效果观察。

1.3 其他饮食诱导模型

Huk等[29]给野生型C57BL/6J小鼠喂食含有200 IU/g视黄醇棕榈酸酯过量维生素A的食物(Harlan，TD.110146)持续12个月，检测到主动脉瓣的峰值压力梯度和速度显著增加，小叶明显钙化结节。该模型主要通过视黄酸(retinoic acid，RA)介导的钙化信号导致转录因子Sox9抑制及其靶基因失调，成骨基因Runx2和骨钙蛋白(bone Gla protein,BGLAP)表达增强，这与先前研究结果一致[30-31]，提示过量膳食维生素A是CAVD发病的危险因素。

模型评价：该模型的优点与其他饮食诱导模型一样，操作简便。但缺点也比较明显，由于造模周期较长，对后续开展相关研究不利，并且对研究人员精力和经济上都是一种挑战。利用此模型可以研究成人过量膳食维生素A对促进CAVD进展的影响，给予CAVD患者在膳食习惯上的指导。

2 基因修饰模型

2.1 基因敲除模型

弹性纤维作为主动脉瓣细胞外基质(extracellular matrix，ECM)的重要组成部分，在结构和功能上具有重要作用[32]。弹性纤维由弹性蛋白(核心蛋白)和微纤维(原纤维蛋白及相关蛋白)，以及各种糖蛋白，如emilins和fibulins组成[33]。Fibulin4-/-小鼠可导致TGF-β信号通路激活，引起主动脉瓣成纤维细胞激活，小叶增厚，骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)激活和营养不良性钙化[34]。同样Emilin1-/-小鼠也能导致瓣膜组织内TGF-β因子失调，引起经典通路Smad2/3和非经典途径细胞外信号调节激酶1和2(Erk1/2)激活，17月龄时主动脉瓣增厚，峰值速度和相应的压力梯度显着增加，组织内血管生成，巨噬细胞浸润，αSMA表达以及纤维化[35]；值得注意的是此模型未检测出钙盐沉积的迹象，但它提供了ECM病理结构的变化，与人瓣膜病的早期病理改变是一致的。Angel等[36]利用此模型证实了主动脉瓣膜病发病前后蛋白组变化与生物力学存在明显的相关性，ECM中蛋白质的变化早于血流动力学的变化。

以往研究证实炎症与钙化性主动脉瓣膜病存在联系，并且白介素(IL)-1β参与了CAVD的发病机制[37-38]。Isoda等[39]发现BALB/c背景的白介素-1受体拮抗剂缺陷(IL-1Ra-/-)雄性小鼠在标准饮食条件下，16周龄时出现主动脉瓣叶增厚，巨噬细胞浸润并含有分化的肌成纤维细胞，43周龄时检测到钙化病变。

模型评价：基因敲除小鼠模型在众多疾病发病机制研究中常用的方法，其优点是小鼠往往是近交品系，同源性好，便于基因编辑操作，能够明确某种特定因素缺失对疾病造成的影响。缺点是基因敲除仅对单一位点实施干预，会影响与钙化性主动脉瓣膜病其他危险因素的相互促进作用，有时还会造成动物模型典型表现(钙化)欠缺。

2.2 基因过表达模型

Cadherin-11(Cad-11)是一种细胞间粘附蛋白，可介导细胞迁移并促进间充质细胞分化为骨和软骨[40]。先前研究表明，在人和动物的钙化性主动脉瓣VIC中发现Cad-11表达明显增加[41-42]；Cad-11缺乏可导致GTP-RhoA和Sox9失活，影响胚胎瓣膜的形成和重塑，进而阻止了成年小鼠的钙化[43]。Sung等[44]运用转基因技术创建了Nfatc1Cre; R26-Cad11Tg/Tg小鼠模型，小鼠在一个月时主动脉瓣厚度或横截面积没有显着差异和其他身体缺陷，10个月时出现主动脉钙化和狭窄伴反流，瓣膜明显增厚(>70%)，横截面积增加(>46%)，射血速度增快，存在成骨细胞标志物肌纤维母细胞(αSMA)和成骨细胞(Runx2，骨钙素)以及阳性的Von Kossa和茜素红染色。该模型小鼠病理学及生物分子学与人钙化性主动脉瓣膜病表现出一致性，作为一种新的模型证实了Cadherin-11过表达通过体内GTP-RhoA介导的成骨和营养不良性钙化以及Sox9介导的细胞外基质重塑诱导主动脉狭窄。

表1 钙化性主动脉瓣膜病小鼠模型Table 1 Mouse models of calcified aortic valve disease

Chu等[45]综合考虑高胆固醇血症和高血压与主动脉瓣膜病的相关性，首次在APOE-/-小鼠基础上利用转基因技术建立了肾素(REN+)、血管紧张素(AGT+)为一体的纤维化性主动脉瓣狭窄(fibrotic aortic valve stenosis，FAVS)模型。标准饮食12个月后表现出严重的主动脉瓣狭窄，相邻瓣膜吻合线明显增长，瓣膜基底部胶原蛋白网状化，伴有轻度钙化。虽然瓣膜钙化不明显，但类似于儿童和一些成年人的主动脉瓣狭窄[46-47]。

模型评价：该模型优点是可以针对特定的主动脉狭窄发病危险因素利用转基因技术检测该基因过表达对机体的影响。缺点是实验成本较高。虽然转基因技术比较成熟,但操作复杂，实验者需要到专业机构购买特定小鼠，并且价格昂贵。

3 先天发育异常模型

流行病学显示先天异常主动脉瓣患者主动脉瓣狭窄的发病率明显高于三尖瓣，并且发病时间会提前10-20年[48-50]。此外钙化性主动脉瓣狭窄的地理分布是异质的，并且显示出聚类效应，表明遗传因素与瓣膜病之间的相关性[51]。

Garg等[52]在同一个家族的五代人的先天性心脏病研究中，首次发现了转录调节因子NOTCH1突变是主动脉瓣钙化的遗传基础，并且通过突变基因的转基因小鼠中证实能够引起心脏瓣膜缺陷。Notch1杂合子(Notch1+/-)雄性小鼠喂食含0.2%胆固醇的高胆固醇饮食10个月后，与WT对照组相比主动脉瓣钙化程度增加5倍，小叶中Bmp2表达增加了3倍以上，虽然小鼠均为没有表现出二尖瓣，但是在三尖瓣中存在钙化，证明Notch1在发育过程中和在抑制出生后的钙化中具有独立的功能[53]。

骨膜素(periostin，POSTN)基因编码的蛋白骨膜素在胚胎发育的心脏流出道(OFT)心内膜垫中高度表达，诱导心脏形成主动脉瓣等多种结构[54]。POSTN基因缺失(postn-/-)小鼠通过诱导Notch1负调控因子δ样同系物(DLK1)的过度表达，主动脉瓣严重变形，并呈双尖瓣样形态，标准饮食6月龄时，von Kossa染色主动脉瓣小叶上有大量钙沉积物，并伴有转录因子Runx2、OPN和骨钙素的表达[55]。

上皮生长因子受体(epithelial growth factor receptor,EGFR)信号传导通路在调节小鼠主动脉瓣的胚胎发育过程中起关键性作用，其主要功能受体缺陷可导致主动脉瓣异常和功能障碍[56]。Weiss等[57]研究表明上皮生长因子受体突变(EgfrVel/+)小鼠瓣膜发育异常发生率约75%，形态类似于人的单尖瓣主动脉瓣；8个月时主要表现为狭窄伴或不伴关闭不全，并且瓣膜功能障碍随年龄增长更加明显；虽然该模型小鼠未表现明显的出间质细胞分化以及钙化迹象，但这与儿童和年轻成人的先天型单尖瓣主动脉瓣临床表现相似[58]，因此可以作为一种先天型单尖瓣瓣膜病动物模型。

模型评价：先天发育异常诱导模型的建立为CAVD遗传因素的研究提供了新的途径，通过对先天发育异常小鼠的观察进一步认识调控瓣膜胚胎发育的信号通路在CAVD发生发展的作用，也可以研究先天型瓣膜病(单尖瓣、二尖瓣)在生物力学方面的作用。缺点是模型成功率低，耗时长，并且在复制模型时操作复杂。

4 手术诱导模型

由于血液动力应力引起的机械损伤被认为是AS的重要危险因素[59]，一种导丝损伤瓣膜的AS模型被建立。Honda等[60]最早通过将超声导丝在超声心动图引导下通过右颈总动脉插入并移动到雄性C57/BL6小鼠的左心室中，导丝的尖端位于瓣膜的左心室侧前后移动20次并旋转50次，从而造成主动脉瓣损伤。大部分小鼠损伤1周后主动脉速度持续性增加，损伤后4周，瓣膜小叶明显增生，射血分数降低，增生瓣膜显示出活性氧的产生增加以及炎性细胞因子和骨软骨形成因子的表达，12周后表现出明显主动脉瓣狭窄，茜素红染色显示瓣膜钙化。但是该方法在操作过程中无法控制对瓣膜造成的损伤程度，导致瓣膜狭窄伴反流的混合型瓣膜病模型和死亡率增加。后来，Niepmann等[61]在此基础上改用多种类型的导丝进行分级损伤瓣膜，对于轻度和中度损伤，使用尖端缩短并焊接的直导丝(雅培HI-TORQUE 0.014′′)，前后移动20次后再分别以2次/秒的速度旋转50次和100次；对于严重损伤，使用尖端附带15°角度的传统导丝(Asahi INTECC MIRACLEbros6)，旋转200次，以此控制瓣膜的轻、中、重损伤程度。该方法能明显控制不同程度狭窄中主动脉反流的发生率，并且术后24 h死亡率从20%降到4.4%。

模型评价：该模型优点是操作简单，造模周期短，模型成功率较其他模型高，其缺陷是造成瓣膜的急性损伤，病理周期短，与人主动脉瓣狭窄漫长的病程不一致。但在病理组织学是相似的，能够形成主动脉狭窄以及钙化，并且具有易操作性，可以作为一种新兴动物实验模型。模型可应用于炎性机制的研究和抑制炎性反应对CAVD进程的影响。

5 展望

动物模型是研究CAVD的病理生物学机制和潜在的治疗干预的重要工具。目前大多数CAVD小鼠模型的建立集中在炎性机制和加快疾病进程的合并症，如高胆固醇血症、糖尿病、高血压等，但仍存在不足之处，未来理想模型应该能够精确测量主动脉瓣所处的高度动态的生物力学效应。由于主动脉瓣独特的解剖位置，使其暴露于血流诱导的剪应力、压力负荷、弯曲变形和ECM的机械阻力下，这些机械刺激中的每一个都调节瓣膜细胞的生物学，因此可能对体内平衡和疾病都有贡献。小鼠模型由于受物种的限制，首先在组织结构上缺乏与人主动脉瓣的三层结构，其次是体型小不利于力学方面的精确测量。我们应该看到在其他动物模型的优势，如猪在组织结构和形态大小与人瓣膜是相似的，可能成为研究生物力学的绝佳模型。然而小鼠模型在基因修饰上的便利性，为生物力学相关信号通路研究提供了可行性。不同物种的CAVD模型都有其局限性和优势，我们利用其优势上的互补，帮助我们对疾病机制更深入的认识。