两种国产与一种进口小鼠肝炎病毒ELISA抗体检测试剂盒的比较研究

方 姣 梁锦宁 方 茜 朱康立 黄海娜 罗秋琳 潘炫孝 郭晓萍

(广西医科大学，南宁 530021)

小鼠肝炎病毒(mouse hepatitis virus，MHV)属于冠状病毒科，是一种高度传染性疾病[1]。MHV是《实验动物微生物学等级及监测》(GB 14922.2—2011)国家标准规定的必检项目，是我国清洁级或以上级别实验小鼠应排除的病原之一。目前，病毒性病原体的检测方法多采取血清学方法。国家标准《实验动物 小鼠肝炎病毒检测方法》(GB/T14926.22—2001)规定的检测方法有酶联免疫吸附实验(ELISA)、间接免疫荧光抗体实验(IFA)和免疫酶实验(IEA)。根据张志妮等[2]报道，对于日常大量样本的MHV快速检测，目前国内检测单位一般采用ELISA初筛，阳性样本用IFA进行复检[2]。因此，选择合适的ELISA检测试剂盒尤为关键。检测用试剂盒的标准化对检测质量有极大的影响，并对检测结果的准确起着决定性作用。检测方法、技术规范和标准化保证研究成果的可靠性和科学性。欧美等国家已研制出了系列化和商品化的高质量检测试剂盒，但是国内检测试剂提供单位集中在2～3家，且侧重不同的方法，可选择性较小[3]。我校实验动物中心目前使用的ELISA试剂盒为美国进口，价格昂贵且货期长，因此不能满足突发情况下的紧急需求。本研究拟对国内两种MHV抗体ELISA试剂盒和国外一种同类试剂盒的灵敏度、特异性、精密性和可信度进行比较，筛选出既经济又可靠且适合我校实验动物中心的检测试剂盒，以提高检测结果的准确度和可靠性。

1 材料和方法

1.1 材料

A和B两种国产MHV抗体ELISA检测试剂盒；进口MHV ELISA抗体检测试剂盒购自美国EBI-Xpress Biotech International；2019年国内送检结果为阴性的10份阴性血清和10份阳性血清来源于本实验室。

1.2 主要仪器

酶标仪(Thermo Fisher Scientific，型号：Multiskan GO)；移液枪(Eppendorf，型号：Eppendorf Research Plus)；离心机(Beckman coulter，型号：Allegra 30R)；37 ℃培养箱(上海一恒科学仪器有限公司，型号：DHG-9070)。

1.3 方法

1.3.1实验操作及判断标准的确定

分别根据试剂盒说明书进行实验以确定判断标准。

①国产MHV抗体ELISA检测A试剂盒(以下简称国产A)：在阴性和阳性对照(阳性对照孔平均值≥1.00，阴性对照孔平均值≤0.20)成立的情况下，临界值=阴性对照孔(平均值+0.15)；待检血清特异抗原孔A值<临界值时，判为阴性；待检血清特异抗原孔A值≥临界值时，判为阳性；②国产MHV抗体ELISA检测B试剂盒(以下简称国产B)：在阴性、阳性对照(阳性对照的阳性孔与阴性孔的差值≥0.6，阴性对照的阳性孔与阴性孔的差值≤0.25)成立的情况下，待检血清阳性孔与阴性孔的差值<0.3时，判为阴性；待检血清阳性孔与阴性孔的差值≥0.3，判为阳性；③进口MHV抗体ELISA检测试剂盒(以下简称进口)，在阴性、阳性对照(阳性对照的阳性孔与阴性孔的差值≥0.6，阴性对照的阳性孔与阴性孔的差值≤0.25)成立的情况下：待检血清阳性孔与阴性孔的差值<0.3，判为阴性；待检血清阳性孔与阴性孔的差值≥0.3，判为阳性。

1.3.2敏感性实验：根据王吉等[4]报道，MHV阳性血清从1∶50依次倍比稀释到1∶12 800，样品设置两个重复，同时设置阴性对照和空白对照，按照以上三种试剂盒各自的判断标准，最大稀释比例的阳性孔为其检测灵敏度。

1.3.3特异性实验：三种试剂盒分别检测试剂盒内的阳性对照，即：MHV、小鼠仙台病毒(SV)、小鼠肺炎病毒(PVM)、小鼠细小病毒(MVM)、小鼠鼠痘病毒(MPV)及小鼠呼肠孤Ⅲ型病毒(Reo-3)。设置阴性和阳性对照，在阴性和阳性对照均成立的情况下，观察每种试剂盒与除MHV外的5种病毒有无交叉反应。

1.3.4精密性实验：同一批次试剂盒，对同一份阳性血清在同一稀释度下同时检测20孔，计算检测结果的批内变异系数。

1.3.5可信度实验：检测上述10份阳性血清和10份阴性血清，验证国产A、国产B和进口三种试剂盒的可信度。

1.3.6统计方法：对所得实验数据用SPSS 20.0统计软件进行秩和检验，P<0.05为差异显著，P<0.01为差异极显著。

2 结果

2.1 敏感性实验

国产和进口试剂盒对试剂盒阳性对照血清检测，从表1检测结果得出，国产B和进口试剂盒检测灵敏度均较高，差异显著(P<0.05)，且进口试剂盒是国产试剂盒B的4倍。

表1 敏感性实验检测结果

2.2 特异性实验

每种试剂盒分别检测各自携带的阳性对照，即：除MHV外的SV、PVM、MVM、MPV及Reo-3病毒阳性血清。实验结果显示，国产A检测上述病毒阳性血清皆为阳性，说明该试剂盒与此5种病毒阳性血清存在交叉反应；国产B和进口试剂盒特异性实验结果均为阴性，说明两种试剂盒与此5种病毒均无交叉反应。

2.3 精密性实验

三种试剂盒精密性实验结果，见表2。国产A的批内变异系数为13.825%，国产B的批内变异系数为13.827%，进口的批内变异系数为5.667%。

表2 精密性实验结果

2.4 可信度实验

国产A中10个阳性血清中有6个阳性样品未被检出，其检测符合率为40%，而10个阴性样品有两个检出为阳性，检测符合率为80%。国产B和进口试剂盒对10个阳性样品均检出了阳性，对10个阴性样品均检出了阴性，检测符合率均为100%，结果如表3。

表3 ELISA检测已知MHV抗体阴性及阳性血清结果

3 讨论

MHV具有极高传染性。根据仇保丰等[5]报道，当感染小鼠群免疫功能下降时，即可能引起整个鼠群爆发性的急性感染，导致动物大量死亡，严重影响实验动物的生产和相关动物实验结果。因此，定期检测MHV，及时淘汰感染动物，可以避免不必要的经济损失。在实际应用中，通常采用ELISA初筛，针对初筛中的可疑样本，进一步用其他检测方法进行验证，确定其准确结果。

检测进口阳性对照血清灵敏度实验显示：国产A和国产B分别为1∶1和1∶400，进口为1∶1 600，说明国产A灵敏度很低，国产B与进口检测进口阳性血清灵敏度均较高(均达到1∶400以上)，进口试剂盒阳性血清灵敏度比国产B高4倍。特异性实验显示：国产A对SV、MPV、PVM、MVM及Reo-3皆检出为阳性，说明此类试剂盒的特异性差；国产B和进口试剂盒对上述5种阳性血清皆检出阴性，表明进口的试剂盒特异性良好。精密性实验显示：国产A的批内变异系数为13.825%，国产B的批内变异系数为13.827%，两种国产试剂盒批内变异系数均大于10%，说明国产A和国产B的精密性较差。进口试剂盒批内变异系数为5.667%小于10%，说明进口试剂盒精密性良好。三者精密性的优劣顺序依次为：进口、国产A及国产B。可信度实验显示：国产A试剂盒阳性检测符合率为40%，阴性检测符合率为80%。国产B和进口试剂盒阴性和阳性检测符合率均为100%，说明国产A试剂盒的可信度低，国产B和进口试剂盒的可信度高。

通过以上研究得到三种试剂盒在灵敏性、特异性、精密度和可信度方面的优点和缺陷，最终筛选到国产B试剂盒既经济又可靠且适合我校动物中心使用的经济实惠的国产MHV抗体检测试剂盒。