柑橘多甲氧基黄酮饼干对高血脂症小鼠的降脂效应

李淑珍杨巍巍康爱娟张建岳祺圣张鑫郭锐唐玲邹春兰姚思彤

(1. 沈阳医学院基础医学院,沈阳 110034; 2. 沈阳医学院公共卫生学院,沈阳 110034)

高脂血症是指血清中的总胆固醇(TC)、总三酰甘油(TG)和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)高出合适范围或高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)低于合适范围[1],是各种心脑血管疾病的危险因子[2]。高脂血症是临床上老年常见病,且发病率在老年人群中逐年递增[3],也是促进高血压、糖耐量异常和糖尿病发生的一个重要危险因素[4]。在现代医药领域,HLP 又称为脂质代谢紊乱,是血液中任何或所有血脂与脂蛋白水平同时异常升高,或单一一种异常升高,是一种最常见的血脂异常形式[5]。高脂血症的预防和治疗已成为亟待解决的难题之一,高脂模型对于脂代谢性疾病以及HLP 继发的心脑血管性疾病的研究具有重大意义[6]

功能性食品是具有特定营养功能特性的食品,主要用于特定人群食用,其原料主要有谷物、豆类、干果和益生菌等,具有调节人体某种生理功能,且不以治疗为目的食品[7-10]。

临床研究表明对人群进行生活方式和饮食的干预会对肥胖的发生起到一定的预防作用[11]。饼干是以小麦粉为主要原料,适量加入糖、奶油、黄油、香精、鸡蛋等辅料,在特定工艺下烘烤而成的口感松脆的食品。随着食品工业的发展和人民生活水平的提高,食品的消费观也在不断地变化,如何吃得健康是当今人们推崇的饮食理念。多甲氧基黄酮(polymethoxy flavones,PMFs)是一类以2-苯基色原酮为母核具有两个或两个以上甲氧基的天然黄酮类化合物,存在于柑橘属植物中,特别是甜橙和柑橘的果皮[12]。PMFs 自21 世纪以来受到广泛研究和关注,已有研究证实柑橘黄酮提取物和柑橘PMFs 具有调控脂质代谢、降血脂和预防肥胖的作用[13-16]。然而,将多甲氧基黄酮直接加入食物中,观察对高血脂小鼠的血脂变化情况则鲜有报道。

本研究采用高脂饲料建立高血脂小鼠为模型,通过在饼干中添加不同剂量的多甲氧基黄酮粉末,检测小鼠体重、Lee′s 指数、脏器变化、肝组织生化指标和血清中血脂含量的变化来评价多甲氧基黄酮饼干的降脂减肥作用。旨在为高血脂人群寻找健康而有效的降脂食物,开发一种新型功能性食品,并为柑橘产品的开发提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

60 只2 ～3周龄KM 系SPF 级雄性小鼠,体重20 ～24 g,购于辽宁长生生物技术股份有限公司【SCXK-2015-0001】。饲养于沈阳医学院动物实验中心SPF 级动物房【SYXK-2015-0021】,饲养环境温度为20 ～24℃、湿度为50% ～60%,12 h 光照/黑暗周期;自由采食基础饲料,自由饮水。所有操作均符合沈阳医学院动物科学实验伦理学要求(批准号:SYYXY2019090301)。

1.1.2 主要试剂与仪器

多甲氧基黄酮粉末(成都曼斯特生物科技有限公司);检测试剂盒HDL-C(High density lipoprotein cholesterol,高密度脂蛋白胆固醇,批号:20190522)、LDL-C(Low density lipoprotein cholesterol,低密度脂蛋白胆固醇,批号:20190521)、TG(甘油三酯,批号:20190522),上述试剂盒均购自南京建成生物工程研究所;非诺贝特片(上海信谊万象药业股份有限公司,批号:130928)。普通饲料购自沈阳医学院实验动物中心,高脂饲料配方为:猪油(28%)、胆固醇(1%)、胆酸钠(0.2%)、蔗糖(16%)、基础饲料(54.8%)。制作饼干所用材料:金沙河家用小麦粉(SC10113052700055,邢台金沙河面业有限责任公司);怡宝纯净水(SC10631011401276,上海麒麟食品有限公司)。

酶标仪(M200,Tecan,瑞士);中药粉碎机(HR-20B,永康市哈瑞工贸有限公司);轧面机(FKM-200,永康市富康电器有限公司);远红外电热食品烤炉(DKL-FB,广东多丽食品机械有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 动物分组及饲养条件

选择健康成年的60 只KM 小鼠在沈阳医学院动物实验中心适应性喂养1周后,随机分出14 只继续饲喂基础饲料作为正常对照组(A 组),其余小鼠为造模组,均饲喂自制高脂饲料用来建造食源性肥胖小鼠模型。据造模小鼠体重超出空白对照组体重10%以上为造模成功标准[17]。6周后挑选成功高脂模型小鼠随机分为5 组包括:高脂模型组(B组),普通饼干组(C 组),阳性药饼干组(D 组),低剂量饼干组(E 组),高剂量饼干组(F 组)。每组8只小鼠,试验持续6周,期间A 组继续饲喂基础饲料,B 组饲喂基础饲料,C 组饲喂无任何添加的饼干,阳性药组饲喂加入阳性药非诺贝特(0.07%)的饼干,E 组和F 组分别饲喂加入多甲氧基黄酮粉末(0.08%、0.16%)的饼干[18]。

1.2.2 饼干制作

(1)溶解辅料:将非诺贝特粉末或多甲氧基黄酮粉末加水溶解。

(2)调粉:将面粉、水倒入和面机中,和至面团手握柔软适中,表面光滑油润,有一定可塑性不粘手即可。

(3)辊轧:将和好后的面团放入辊轧机,多次折叠反复并旋转90°辊轧,至面带表面光泽形态完整。

(4)成型:用饼干模将面带成型。

(5)烘烤:将饼干放入刷好烤盘中,入烤箱200℃烘烤,烘烤时间为12 min。

(6)冷却:将烤熟的饼干从烤箱中取出静置,冷却至40℃以下包装。

各饼干组饲料配比为:面粉、油、糖和奶粉含量分别为100、10、15、5 g,E 组和F 组分别添加多甲氧基黄酮粉末0.08 g 和0.16 g,D 组添加非诺贝特粉末0.07 g。

饼干饲料总能量为17.01 KJ/g,营养素参考值为20%。营养成分配给为:蛋白质、脂肪和碳水化合物含量分别0.072、0.088、0.733 g/g,营养素参考值分别为12%、15%和25%;钠含量为0.68 mg/g,营养素参考值为3%。

1.2.3 给药前后对模型小鼠体重的影响

以实验前体重为初始体重,并在第6周高血脂模型测试时称取体重,后连续给药6周,并在第9、12周末记录各组小鼠体重。

1.2.4 Lee′s 指数测定

试验期间,分别于6、9、12周末正常饮水,空腹12 h 过夜测定各组小鼠体重和体长(体长定义为鼻尖到肛门的距离),按照如下公式计算出小鼠Lee′s指数(LI):LI=[体重(g)1/3×103/体长(cm)]

1.2.5 脏器系数测定

解剖小鼠时,小心取出各脏器组织,生理盐水清洗后称重,-80℃储存,小鼠体重以g 为单位,主要脏器质量以mg 为单位,脏器系数(脏器质量/体质量)以百分数表示。

1.2.6 血清血脂水平的测定

试验期间,分别于6、9、12周末对小鼠进行腹腔麻醉,并眼眶取血采集血液样本,25℃放置2 h 后,3000 r/min 离心10 min,离心取上层血清,用试剂盒测定小鼠TG、HDL-C、LDL-C 浓度。

1.2.7 肝组织生化指标测定

取第9周肝组织,室温解冻肝组织,以1 ∶10 的比例制备肝/异丙醇匀浆液,6000 r/min 离心取上清,按试剂盒说明测定TG、LDL-C、HDL-C 水平。

1.3 统计学分析

本试验得到数据均以平均值±标准误差(±s¯x)表示,并使用SPSS 19.0 软件进行统计分析,两组间差异采用t检验分析,多组间差异采用单因素方差分析,方差齐性采用LSD 检验,方差不齐采用Dunnet T3 检验,P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 动物模型成功性考察

连续喂养6周,第6周末称取小鼠体重,禁食不禁水12 h,眼眶采血检测TG、LDL-C、HDL-C 含量,统计结果显示实验组小鼠体重均超过空白组小鼠体重的10%,血清TG、LDL-C 较正常组含量升高,HDL-C 含量相对降低,表明高血脂模型建造成功。

2.2 多甲氧基黄酮饼干对小鼠体重的影响

整个实验周期内,各组小鼠生长状态良好,无死亡现象。综合比较实验前、6周后、9周后及12周后各组小鼠的体重平均值,由图1 可以看出,实验前各组小鼠按体重随机分组,使各组体重无明显差异,可以减小分析误差;第6周(造模后)各组小鼠体重均显著升高,各实验组高于A 组(P＜0.01),表明高血脂模型已经建成。第9周(给药后3周)各实验组仍显著高于A 组(P＜0.01)。C、E 组与B 组无统计学差异。D、F 组与B 组有统计学差异(P＜0.05)。第12周(给药后6周)B、C、E 组极显著高于A 组(P＜0.01)。D、F 组与B 组具有统计学差异(P＜0.05)。喂养6周后体重增加明显,给与降脂饼干后,第9周D 组、F 体重下降明显,其余各组体重无明显变化。第12周D 组和F 组体重下降明显,F 组在降低体重方面比E 组明显。C 组与B 组体重无统计学差异。

图1 各组小鼠体重比较(n=8)Note. Compared with group A, ∗∗P＜0.01. Compared with group B, #P＜0.05, ##P＜0.01. (The same in the following figures)Figure 1 Comparison of body weight of mice in each group(n=8)

2.3 多甲氧基黄酮饼干对小鼠Lee′s 指数的影响

Lee′s 指数是评价小鼠肥胖程度方面的有效指数。由图2 可以看出:第6周,B 组和其余各组比A组明显升高(P＜0.01)。第9周,各实验组高于A组(P＜0.01)。D、F 组与B 组具有统计学差异(P＜0.01)。第12周,B、C、E 组显著高于A 组(P＜0.01)。D、E、F 组均显著低于B 组(P＜0.01)。说明高脂膳食导致小鼠肥胖从而使Lee′s 指数升高,长期饲喂多甲氧基黄酮饼干可以降低肥胖小鼠的Lee′s 指数,高剂量比低剂量效果更加明显。普通饼干对小鼠无明显影响。

2.4 多甲氧基黄酮饼干对小鼠各脏器指数的影响

脏器指数能反映实验动物的营养状态和各脏器的病变情况,由图3A 可知,本实验所制作的多甲氧基黄酮饼干对心指数并无明显影响。由图3B 可知,对于肝方面,第12周,B 组和C、D 组高于A 组(P＜0.05),其他各试验组均低于B 组(P＜0.05)。说明持续饲喂多甲氧基黄酮饼干可有效控制肥胖小鼠肝指数。D 组肝指数与B 组无统计学差异。图3A 所示在脾方面,第12周,B 组与A 组具有统计学差异(P＜0.05)。D 组与A 组具有统计学差异(P＜0.05)。其他各剂量组与A 组无统计学差异(P＞0.05)。D、F 组与B 型组差异具有统计学差异(P＜0.05)。各剂量组脾指数均高于B 组。以上说明,高脂饲料对脾指数有一定的影响,阳性药和多甲氧基黄酮饼干可提高脾指数。普通饼干对小鼠无明显影响。图3B 所示在肾方面,第12周,各试验组均显著高于空白组(P＜0.05)。说明高脂饲料可一定程度的使肾指数增加,而阳性药和多甲氧基黄酮饼干对其没有显著作用。

2.5 多甲氧基黄酮饼干对小鼠血清血脂水平的影响

由图4 可以看出:TG 方面,第12周,各实验组与A 组均具有统计学差异(P＜0.01),TG 值高于A组。D、E、F 组与B 组具有统计学差异(P＜0.01),其中F 组效果较好。对血清中LDL-C 影响方面,由图4 可以看出,第12周,D、E、F 组与B 组具有统计学差异(P＜0.01),LDL-C 值均高于A 组,但与A 组已没有显著差异。长期饲喂高脂饲料可以升高小鼠血清中的LDL-C 的水平,喂养降脂饼干对其有一定的影响,可以降低LDL-C 的水平,高剂量组比低剂量组效果好。HDL-C 方面,第12周,各实验组与A 组均具有统计学差异(P＜0.01),HDL-C 值均低于A 组。D、E、F 组与B 组均具有统计学差异(P＜0.01)。可以看出,长期以高脂饲料喂养小鼠可以降低小鼠HDL-C 值。实验进行到第12周,降脂饼干可以缓解这种趋势,但还是低于A 组,说明阳性药和降脂饼干对高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)的影响较小。

图2 各组小鼠Lee′s 指数比较Figure 2 Comparison of Lee′s index of mice in each group

图3 各组小鼠第12周脏器指数比较Figure 3 Comparison of organ indexes of mice in each group at the 12th week

图4 各组小鼠第12周血脂水平比较Figure 4 Comparison of blood lipid levels of mice in each group at the 12th week

2.6 多甲氧基黄酮饼干对小鼠肝组织生化指标的影响

肝是体内脂肪代谢的主要器官,一旦肝被损伤,机体的脂肪代谢将会发生异常[19]。由图5 可以看出实验进行到第12周时,各组小鼠的TG 值方面,B、C、E、F 组与A 组具有统计学差异(P＜0.01)。D 组与A 组无显著差异。D、E、F 组与B 组具有统计学差异(P＜0.01)。各组小鼠的LDL-C 值方面,B、C、E、组与A 组具有统计学差异(P＜0.01)。D、F 组与B 组具有统计学差异(P＜0.01)。HDL-C 值方面,B、C、E 组与A 组具有统计学差异(P＜0.01)。各组与B 组均具有统计学差异(P＜0.01)。可以看出,饲喂小鼠多甲氧基黄酮降脂饼干对改善高血脂症小鼠肝组织中的指标有一定效果,而且高剂量效果比低剂量效果好。

图5 各组小鼠第12周肝组织生化指标比较Figure 5 Comparison of liver tissue biochemical indexes of mice in each group at 12 weeks

3 讨论

多甲氧基黄酮饼干能明显改善高血脂模型小鼠血清中常见生化指标的脂代谢异常。血脂含量测定显示,饲喂高脂饲料可以提高TG 和LDL-C 水平,降低HDL-C,多甲氧基黄酮饼干能够降低高脂小鼠的TG 和LDL-C 水平,缓解HDL-C 的升高趋势。降低高血脂小鼠的Lee′s 指数,抑制体质量的增长,能够改善高脂膳食引起的肥胖,同时对肝具有保护作用,也适用于预防血脂异常和脂肪肝等相关疾病。目前有关柑橘黄酮调节脂质代谢研究甚多,柑橘黄酮可以减少巨噬细胞对氧化低密度脂蛋白的摄取和巨噬细胞内胆固醇酯的积累,抑制肝脂质积累和脂蛋白的过量生产,从而降低动脉粥样硬化发生和发展的风险,然而降脂机制尚未完全明确[20]。本研究以柑橘多甲氧基黄酮及其制作的饼干为研究对象,通过喂食高脂饲料建立高血脂模型小鼠,经过喂养降脂饼干干预后对相关生化指标进行检测。降脂饼干在体重方面,高剂量组降低体重效果较好,对Lee′s 指数也有影响。对脏器指数的影响:对心、肾指数没有明显影响,略提高高血脂小鼠的脾指数。对肝指数方面高剂量组影响明显,存在一定的剂量关系,非诺贝特降脂饼干显示增加小鼠的肝指数,可能为非诺贝特一方面提高LPL 活性,促进CM、VLDL 中TG 的脂解,使血、肝组织内游离脂肪酸增多,另一方面减少VLDL 在肝的合成和分泌,从而导致肝细胞内脂肪合成和分泌失衡,引起肝细胞内脂肪沉积加剧[21]。降脂饼干对小鼠血脂影响方面:降脂饼干对TG 的影响明显,对HDL-C没有明显影响,对LDL-C 影响较为明显。

本实验是以小鼠来建立高血脂模型的,根据目前国内外已有的研究结果,用来建立高血脂模型的动物还有长爪沙鼠[22]、金黄地鼠[23]、食蟹猴[24]、悬猴、鹌鹑、鸡、家鸭、beagle 犬、五指山小型猪和鸽子等,具体选用用于建立高脂模型的动物种类应当根据研究需要进行合理的选择。

随着近年人们对食品营养素需求量的提高和对粗粮食品的重视,在其中添加一些对人体有益的元素更容易受到大众的青睐[25]。由于市场对新奇食品的需求逐渐旺盛,开发一些具有药用性饼干也具有重要的现实意义。从药用、保健食疗、食品色素角度开发多甲氧基黄酮,制成功能性食品,具有广阔的市场应用前景,并能产生较大的社会和经济效益。而功能性食品是人们对传统食品的深层次需求,是21 世纪食品工业发展的主流方向,世界各国都非常重视功能性食品的研究与开发[26]。随着国家公众营养计划的稳步推进,未来人们对功能性食品的认可程度和接受程度只会越来越高[27]。