高通量测序技术在新生儿疾病筛查中的应用进展

吴 爽，强 荣，张瑞雪，华 伟

(1.西安医学院，陕西 西安 710000；2.西北妇女儿童医院医学遗传科，陕西 西安 710061)

新生儿疾病筛查(newborn screening，NBS)是一项成功的公共卫生项目，是指在新生儿期对严重危害新生儿健康的先天性、遗传性疾病施行专项检查，在出现症状之前提供早期诊断和治疗，从而改善临床结果[1]。1963年，Guthrie和Susi[2]首次报道了细菌抑制试验筛查苯丙 酮尿症(phenylketonuria，PKU)，开启了新生儿筛查的序幕。随之，酶活性测定半乳糖血症、放射性免疫法筛查先天性甲状腺功能减低症(congenital hypothyroidism，CH)均获得成功，至此以PKU和CH为主的NBS在欧美发达地区迅速开展。到20世纪90年代，串联质谱技术的出现使NBS发生了革命性的转变，它可以通过一次实验筛查多种疾病，大大扩展了筛查病种[3]。如今，NBS已在国际上广泛推广，是国际公认的降低新生儿疾病发病率及死亡率的重要措施。

目前，NBS筛查方法主要包括质谱技术、免疫学方法、酶学、高压液相色谱及电泳等。通过检测生化指标发现新生儿体内异常的代谢改变，进而实现疾病的早期诊断。除CH外，现阶段的NBS筛查病种均属于遗传性疾病。据统计，活产新生儿中不同种类遗传性疾病占3%～5%[4]，使这些患儿面临早期死亡或致残。某些疾病，如PKU，早期干预可明显改善预后，因而尽快明确诊断尤为重要。但是目前筛查技术存在筛查病种有限，漏检，并可能存在假阴性及假阳性等缺点，还不能完全满足临床需求。随着分子生物学的发展，DNA测序技术为NBS开辟了新的途径。高通量测序技术(next-generation sequencing，NGS)也称下一代测序技术，相较于传统的一代测序技术，它以成本低、通量高、速度快的特点在优生遗传领域得到了广泛的应用，其主要包括：遗传病的诊断、携带者筛查、植入前遗传学检测、临床用药指导等。NGS按照测序覆盖范围大小大致分为：全基因组测序、全外显子组测序、靶向目标基因测序。该技术通过一次性检测数百至数千种基因变异，实现在分子水平对遗传性疾病的精准诊疗。在新生儿领域，NGS技术已作为新生儿遗传性疾病确诊的重要依据。近年来，该技术在NBS方面的应用处于探索中，现对NGS在NBS方面的研究进展进行综述。

1高通量测序技术作为二级NBS手段的应用

目前大部分NBS的模式是将NGS作为二级筛查手段，即对生化筛查阳性患儿或疑似患儿进行测序，以明确诊断、治疗指导和预后评估[5]。该种筛查模式在一些疾病中运用较为成熟，如遗传代谢病(inherited metabolic disorders，IMD)、严重联合免疫缺陷病、囊性纤维化等。以IMD为例，串联质谱技术目前在新生儿IMD的筛查中已得到广泛应用，它可以在短时间内对1个样本进行几十种代谢产物的分析，具有高灵敏性和特异性及快速、成本低的优势。由于IMD没有特定的临床表现，且质谱检测病种有限，同时涉及多个指标和比率，临床较难判断。如甲基丙二酸血症和丙酸血症质谱指标均为C3及C3/C2。更有许多IMD存在亚型，并且不同亚型治疗方案均有不同。因此，对质谱后出现可疑阳性结果的患儿进行准确诊断非常重要，NGS能够同时对多种基因进行突变分析，成为现阶段遗传代谢病诊断的重要手段。有研究对1 033例质谱阳性患儿进行NGS，共诊断出各类遗传代谢病194例，NGS均确定了疾病类型。鉴定出23种IMD，包括10种氨基酸代谢异常(43.5%)、8种有机酸缺陷病和5种脂肪酸氧化缺陷病[6]。另外，串联质谱结果反映的是体内代谢物的异常，会受到婴儿出生时的孕周、输血情况、年龄等混杂因素的限制，NGS可以在分子层面提供明确诊断，以弥补质谱技术的不足[7]。由于质谱技术容易受环境因素的影响，无法区分受影响的患者及杂合携带状态。有研究表明，NGS在解释NBS中代谢物浓度异常方面很有价值，它可以区分此种情况，并可减少诊断的时间[8]。

但迄今为止，与质谱技术的方法相比，基因检测较质谱技术费用高，检测周期长，并且会带来庞大的数据分析和难以解读临床意义的不明变异，会给临床实验室带来很大的挑战。有研究对102例疑似IMD患儿进行了NGS，当生化实验提示某种单基因病或特定的IMD时，NGS可以确诊59%(39/66)的患儿，而当怀疑IMD但无临床表型及生化特异性时，只有8%(3/36)的患儿通过NGS得到了诊断[9]。这说明了生化检查和临床表型在指导NGS数据分析中的作用。由美国国立卫生研究院(national institutes of health，NIH)资助的基因组医学和公共卫生的新生儿测序(newborn sequencing in genomic medicine and public health，NSIHT)联盟成立于2014年。NBseq计划是NSIHT项目之一，它在182个经生化检测确诊IMD的患儿样本中，发现DNA测序遗漏了约20%确诊病例，这些病例都是非常罕见的疾病，其中一些可能是由于DNA重组或调节基因活性的区域发生突变，外显子测序无法检测，使用全基因组测序又较为昂贵，并且结果解读更具有挑战性[10]。最近一项研究显示，全外显子测序技术(whole exome sequencing，WES)对于IMD的敏感性为88%，特异性为98.4%，而串联质谱技术分别为99.0%和99.8%[11]，表明现阶段NGS并不适合代替生化检查作为一级的遗传代谢病筛查方法。因此，将NGS技术应用到NBS中仍然是作为生化检测结果阳性后的二级筛查方法。综上所述，NGS和质谱技术对IMD的筛查各有利弊，需要优势互补，才能发挥在临床上的最大价值。

2高通量测序技术作为一级NBS手段的应用

随着NGS成本的下降和基因数据库的更新完善，人们开始考虑如何更大规模地应用DNA测序，并扩展筛查病种，以更早地发现由于基因缺陷而导致的新生儿健康问题，以及如何利用分子生物学改善儿童的临床结局。

2.1高通量测序技术应用于高危新生儿疾病的筛查

任何一项技术运用于临床中都是循序渐进的过程。在新生儿重症监护室(neonatal intensive care unit，NICU)中，遗传性疾病和先天异常是导致患儿死亡的主要原因，将NGS运用于NICU中患儿的筛查是人们考虑进行广泛NGS的第一步。对于危重患儿，得到准确诊断关乎生死，并可以缩短住院时间，改善临床结局。Meng等[12]对278名小于100天的NICU婴儿进行WES测序，总体诊断率为36.7%(102/278)，改善临床结果52.0%(53/102)；另一项研究对25名NICU患儿行WES，诊断率为60%，改善临床结果83%[13]，说明NGS测序是一种强大的工具，其使用对临床决策有显著影响。除此之外，NICU中的早产儿会因为器官系统不成熟，如肝脏酶活性较低、长期肠外营养需求等，会使NBS出现假阳性结果，需要反复进行NBS和额外的后续检测，NGS可以帮助解释此种情况[14]。有研究对NICU中的48例新生儿(非IMD疑似患儿)进行了NGS，共检测到11例新生儿中有13种可能致病或致病突变，该研究的入选人群并不局限于怀疑患有特定遗传代谢病者，为NGS用于NICU中患儿疾病的筛查提供了参考[15]。但是，由于测序结果的解释可能会模棱两可，测序中还会有次要发现，而且父母可能因为其产生的焦虑情绪及经济压力，使这种方法在临床上的运用受到了阻碍[16]。

2.2高通量测序技术应用于普通新生儿的筛查

基因组测序作为“个性化”或“精确”医学的一部分，在医学领域具有更广泛的实际潜力[17]。1990年，沃尔特·吉尔伯特(Walter Gilbert)就预示了这一点，其推断到2030年或2040年，所有新生儿出生时都会进行基因测序，有朝一日基因测序将成为NBS的重要手段。

普通新生儿无相关的临床表型，对其进行基因测序主要是为了当前或未来疾病发生风险的预测。早些年，仅有少许国外文献报道将NGS用于普通新生儿疾病的筛查[18]。对于发病概率很小的无症状人群，基因组测序的阳性或阴性预测价值尚不清楚，但是对于目前缺乏常规生化NBS方法的罕见疾病，可以将NGS用于一阶筛查，筛查何种疾病需要仔细考虑各种因素，如发病年龄、严重程度、外显率、确诊方法、可治疗性及预后[16]。BabySeq计划[19]也是NSIHT项目之一，目的在于探索NGS在健康和患病新生儿中的应用情况，并评估NGS的医学、行为和经济影响。它对127名普通新生儿和32名NICU中患儿进行WES测序，结果提示9.4%(10个普通，5个NICU)的新生儿有儿童期患病风险；另外在85名(3.5%)父母同意接受检测关于成人发病风险变异的新生儿中，发现有3名(3.5%)会导致遗传性乳腺癌、卵巢癌或林奇综合征的致病变异，还发现有7名新生儿与药物基因组学的相关变异[7]。该研究表明了NGS可以提醒携带者的父母注意遗传风险，辅助临床医生为患儿家庭提供生育咨询，且药物基因组变异可以指导患儿选择用药。BabySeq计划还分析了493位新生儿父母及144位临床医生对NBS和NGS效用和差异的看法，大多数父母(71%)和临床医生(51%)都认为NGS对孩子健康有益，但其觉得NGS(35%，70%)比NBS更具有风险(19%，39%)(均P<0.05)。与临床医生相比，新生儿父母们认为NGS的益处更多，风险更小；而与其父母相比，临床医生更关注与基因测序相关的隐私和歧视问题。大多数父母(93%)和所有临床医生(100%)都同意新生儿在出生后均应进行NBS，但只有33%的父母和8%的临床医生认为所有新生儿都应进行基因测序[20]。所以当想要将NGS广泛实施前，除了关注其在临床上使用的优势和缺点外，还有必要去了解新生儿父母和临床医生对NGS的态度、看法，以及怎么接受和评价NGS的诊断结果。

3展望与挑战

高通量测序可通过一次性检测数千种致病变异缩短诊断疾病的时间，甚至可检测出未知的基因突变，明确未来疾病的发生风险，为早期干预、预防健康问题提供可能。这一系列优势使其近几年得到了迅速发展，但与此同时，它也面临着诸多挑战。第一，主要是对基因变异的解释，尤其对特定变异可能出现的临床表型、严重程度和发病时间的预测尤其困难，现仍然缺乏足够大的特定种族基因数据库来准确评估某些变异的可能致病性。这些无法解释的突变，统称为意义未知的突变(VUS)，会构成风险低估(突变是致病的，与疾病相关，被解释为良性)和风险高估(良性突变被误解为致病)的双重危险。所以这一难题需要通过国际间联合构建共享数据库，以可靠的实验室快速诊断技术，解决庞大的数据分析问题。第二，目前全国范围内的NBS是国家优生优育强制性的政策。若在新生儿筛查中引入NGS，因为涉及隐私、伦理问题及对意义未知突变带来的心理压力，可能会遭到父母的拒绝。针对这种情况，可以设计一组与可防可治疾病相关的高风险基因突变位点进行靶向基因测序，并且这些疾病得到良好预后的关键是从新生期或幼儿时期就开始干预。同时，它也不太可能取代目前所有的NBS手段，因为串联质谱等生化测试在检测某些疾病方面更具有优势，所以须将各种检验手段依据其优势应用于临床，才可以使检验手段更加成熟完善。