脑缺血后神经发生与修复及中药对其作用研究的进展

高家乐,姚明江， 徐 立， 任钧国， 刘建勋

(中国中医科学院西苑医院基础医学研究所中药药理北京市重点实验室，北京 100091)

缺血性脑卒中是脑卒中最常见的类型，目前是用重组组织型纤溶酶原激活剂进行溶栓治疗，但需要在病发后4.5 h内使用，只适用于3%-5%的脑卒中患者[1]。缺血性脑卒中所致脑损伤的患者常患终身残疾，目前治疗并不能够完全改善疾病后遗症[2]。脑缺血后神经功能的重建与修复是治疗该病的关键，研究表明，包括细胞移植和刺激内源性神经发生在内的以干细胞为基础的治疗，是修复和再生受损大脑的潜在策略，可能为缺血性脑卒中提供第二个治疗时间窗口[3]。中药在临床应用于治疗缺血性脑血管疾病中，根据疾病的病理病机采用辨证论治的不同治法，如益气活血、补益肝肾，滋阴潜阳、化痰通络等[4]，通过综合调节发挥脑缺血后神经修复的优势。该文从脑缺血后神经发生的过程、影响神经发生的因素及中药对其干预作用进行阐述，以期为今后促进脑缺血后神经再生与修复的相关研究提供一些参考。

1 神经发生相关概述

1.1 内源性神经发生神经干细胞(neural stem cell，NSC)是具有多潜能的、能够自我更新和分化可产生神经元、星形胶质细胞及少突胶质细胞的一类原始母细胞[2]，内源性NSC来源于个体本身，在成年哺乳动物脑内的脑室下区(subventricular zone，SVZ)、海马齿状回(dentate gyrus，DG)的颗粒下区(subgranular zone，SGZ)、脊髓、纹状体、大脑皮层等部位有所分布[5]。神经发生是指NSC经历对称和不对称分裂后增殖、分化成为定向祖细胞，逐渐向功能区域迁移、不断发生可塑性变化并与其他神经元建立突触联系，从而产生神经功能的过程[6]。实际上，不单是胚胎和围产期发育阶段，在整个成年期脑内的不同区域也存在着神经发生，其中SVZ和SGZ是两个主要的神经发生位点。正常情况下内源性NSC一般处于相对静息的状态，但脑缺血发生后可刺激这些区域的内源性NSC增殖、迁移、分化和整合，从而激活成年脑内的神经发生。

1.2 成年脑内SVZ和SGZ区正常和脑缺血时神经发生过程侧脑室SVZ区NSC是GFAP呈阳性的放射状胶质样B型细胞，可产生GFAP呈阴性的转运放大C型细胞，这种C型神经祖细胞又可产生表达DCX的A型迁移神经母细胞，这些神经母细胞沿着吻侧迁移流迁移到达嗅球，在那里发育为成熟的神经元，参与嗅神经再生。和SVZ区的B型细胞类似，海马齿状回SGZ区的I型NSC呈现类似的放射状胶质样形态，GFAP呈阳性，激活后可产生GFAP呈阴性的II型神经祖细胞(neuronal progenitor cell，NPC)，其可进一步细分为IIa和IIb型，其中IIb型细胞是早期的NPC，可产生表达DCX的III型神经母细胞，然后迁移到颗粒细胞层，退出细胞周期最终分化形成新的成熟神经元，将轴突投射到海马CA3区，树突投射到DG的分子层，并与内嗅终端形成突触[7]。而脑缺血发生后除了增强SVZ和SGZ固有的内源性神经发生外，在损伤区分泌的化学引诱物如脑内皮细胞分泌的基质细胞衍生因子-1(stromal cell-derived factor 1，SDF-1)和血管生成素-1等引导下，部分新生的成链状的神经母细胞能够从SVZ沿着血管、星形胶质细胞等迁移支架向受损的缺血区域如皮层、纹状体等部位进行长距离迁移，以重新填充受损的脑组织，但是这种向病变区域的迁移效率低下[8]。大多数研究认为这种诱发的自发性神经发生是有益的，但力量很弱，因为绝大多数神经元会死亡，缺乏存活下来的高质量的新生神经元，所以不足以修复脑缺血后的神经损伤。

2 影响脑缺血后神经发生与修复的因素及中药干预作用

2.1 炎症脑缺血后复杂的局部微环境会影响神经发生，适宜的微环境有利于NSC的增殖、分化和迁移，炎症反应通过炎性因子来改变脑组织微环境从而影响神经发生。脑缺血后可激活小胶质细胞，双向调节神经发生的过程，其既能呈现M1表型，分泌如IL-1β、IL-6、TNF-α、IFN-γ等促炎因子和活性氧，一般认为M1表型小胶质细胞能够抑制神经发生，加重神经元损伤；小胶质细胞也可呈现M2表型，分泌如IL-4等抗炎因子和碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)、脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)等，刺激神经元的增殖、迁移、分化、存活和调节突触成熟，有助于神经发生[3]。小胶质细胞的激活状态在脑卒中急性期、亚急性期和慢性期这三个不同阶段有所变化且和缺血的严重程度及位置相关[9]。炎症和随后的神经发生二者相互作用复杂，炎症对于脑卒中后神经发生是有益还是有害仍存在争议，需要进一步研究。

中药通过调控炎症发挥对脑缺血后神经发生与修复的干预作用。Sun等[10]发现，缺血小鼠经过静脉注射黄芪甲苷Ⅳ(astragaloside Ⅳ，AsIV)给药治疗后，海马神经元增多，顶端树突长度及其棘突密度增加，海马SGZ区DCX、BrdU和Sox2蛋白的表达增加，显著降低了脑卒中诱导的IL-17在缺血同侧海马的过度表达，机制为AsIV通过激活Wnt信号通路，下调促炎因子IL-17的表达，从而促进脑卒中后海马神经发生和NSC增殖，改善脑卒中引起的认知功能缺陷。中医认为，缺血性脑卒中的病机为气虚血瘀，关键是本虚，气血津液不足，脏腑机能低下。川芎为血中气药，具有活血行气，祛风止痛的功效，散中能补，是临床治疗脑卒中的常用药。Wang等[11]利用微球栓塞(microsphere-embolized，ME)法诱导持续脑缺血，研究发现，川芎(Rhizome Ligusticum Chuanxiong，LC)提取物能减轻ME所致大鼠海马神经元的凋亡和病理形态学改变，在术后14 d能显著增加成年大鼠海马DG内DCX阳性细胞的产生和NeuroD1表达的密度，与模型组相比，给与LC灌胃给药治疗后，GAP-43蛋白显著上调，促炎因子IL-1β、TNF-α和GFAP蛋白水平降低，表明LC通过促进脑缺血后海马神经发生和抗炎来发挥神经保护作用。Zhang等[12]利用短暂性大脑中动脉阻塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)诱导脑缺血模型小鼠，在造模前使小鼠口服丹参-川芎-红花(Danshen-Chuanxiong-Honghua，DCH)提取物，剂量为10或20 g·kg-1·d-1，连续5 d，发现经过DCH预处理后可改善MCAO小鼠的神经功能，减轻脑梗死面积和脑水肿以及改善细胞凋亡和抑制炎症反应。给MCAO大鼠口服DCH提取物，剂量20 g·kg-1·d-1，连续28 d，发现经过DCH慢性治疗后可明显改善缺血诱导的空间记忆损害，增加海马DG区BrdU阳性细胞的数目，促进固有的神经发生过程，并增加海马病变区BDNF的表达,表明DCH通过抑制微环境炎症和促进海马神经发生，从而发挥恢复认知功能障碍和抗脑缺血损伤的神经保护作用。

2.2 神经血管单元缺血性脑组织的重塑涉及神经元、胶质细胞和微血管细胞之间的相互作用，从而创造一个可能产生神经恢复的微环境。神经血管单元(neurovascular units，NVU)的神经组分由神经元和胶质细胞(小胶质细胞、星形胶质细胞、少突胶质细胞)组成，血管组分由内皮细胞、周细胞和血管平滑肌细胞组成，提供协调的神经血管偶联并维持血脑屏障的功能[13]。脑卒中诱导的神经发生和血管之间存在联系，脑卒中可增加血管生成，从原有血管中生成新的微血管，新旧血管似乎均可作为迁移支架使新生的神经母细胞向损伤区迁移，故重塑受损区域的血管网络和调节新生神经元的迁移方向可提高血管引导下的神经元迁移和再生的效率。缺血区活化的内皮细胞可分泌血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)，促进NSC增殖和神经元分化，还能分泌BDNF、FGF-2、促红细胞生成素和胰岛素样生长因子-1,显著增加SVZ和SGZ区中祖细胞的增殖[1]。

中药通过调控神经血管单元发挥对脑缺血后神经发生与修复的干预作用。肾虚血瘀导致脑卒中发病，加重疾病恶化，而脑为髓海，通过补肾益髓，化瘀通络，能够到治疗和保护作用。熟地甘温，补肝肾之阴，具有补血养阴、填精益髓的功效，为养血补虚之要药，葛根又能够通经活络。Xue等[14]研究发现，中药熟地和葛根中的有效成分梓醇和葛根素(catalpol and puerarin，C-P)二者结合制成C-P冻干粉后，能够通过抗氧化应激、抗炎、保护血脑屏障和上调保护因子来保护整个NVU，显著减轻缺血/再灌注大鼠的神经功能缺损、脑梗死面积，促进梗死区星形胶质细胞突起和延长神经元轴突。双侧颈总动脉结扎(2-vessel occlusion，2VO) 手术后脑血流量降低，可导致慢性全脑缺血，常用来制作慢性脑低灌注动物模型和研究血管性痴呆。Li[15]等利用改良的2VO法制作慢性脑低灌注(chronic cerebral hypoperfusion，CCH)大鼠模型，发生以炎症激活、神经元丢失和星形胶质细胞增生为特征的复杂变化，这是CCH大鼠学习记忆能力低下的基础。模型组大鼠海马CA1区关键蛋白NF-kB p65、Bax、GFAP表达明显上调，MAP-2、Olig2和Bcl-2表达明显下调，加味薯蓣丸(Modified Dioscorea Pills，MDP)可逆转这一趋势，同时进一步上调GAP-43 mRNA和VEGF mRNA的表达以促进神经再生。结果表明MDP通过调节参与炎症、凋亡、神经发生、血管生成和星形胶质细胞增生的关键蛋白和基因的表达来抑制炎症、细胞凋亡和胶质增生，促进海马NVU固有结构的恢复，有效改善CCH大鼠的学习记忆障碍。

2.3 外源性干细胞移植移植的干细胞有分化为特定的细胞亚型如神经元、内皮细胞和胶质细胞的潜能，功能性整合到宿主回路中，以便恢复整个神经血管单元和重新填充受损的区域。然而，外源性干细胞移植治疗面临免疫原性、整合度难、癌变性、伦理方面以及技术等问题。用来治疗脑卒中的干细胞来源有NSC、胚胎干细胞、诱导型多潜能干细胞和间充质干细胞(mesenchymal stem cell，MSC)等，其中MSC最有前景。MSC易于获得，可分泌多种生长因子和神经营养因子，促进神经发生和血管生成以及调节炎症反应，增强内源性神经发生与修复[1]。Shiota等[16]研究发现，将骨髓间充质干细胞株B10移植到MCAO大鼠后，通过增加SDF-1和多聚唾液酸酶的表达能够促进脑缺血状态下内源性NPC的增殖和迁移；Sheikh等[17]发现，其也能通过调节缺氧诱导因子-1α和VEGF表达促进MCAO大鼠血管生成，在此过程中，IL-1β可能起重要作用。外源性干细胞移植途径包括直接注入梗死灶、静脉/动脉注射后通过血液扩散和腰椎穿刺注射后通过脑脊液扩散，目前关于移植治疗结果的报道有好有坏，移植的有效时间窗、最佳细胞量、移植方式等[2]仍需进一步的研究。

外源性干细胞移植结合中药干预发挥对脑缺血后神经发生与修复的作用。Liu等[18]发现， MSC移植联合淫羊藿苷(Icariin，ICA)治疗可显著降低脑缺血/再灌注大鼠的脑梗死面积，改善运动和躯体感觉功能以及空间学习和记忆功能，ICA和MSC主要通过PI3K和ERK1/2信号通路分别促进缺血区额叶皮质和海马中BDNF和VEGF的产生，二者在作用部位上互补，功能上相互增强，促进体内的血管生成和神经发生。Li等[19]研究发现，骨髓MSC移植联合川芎嗪治疗能够显著上调SDF-1和CXC趋化因子受体4的表达，并促进骨髓MSC向脑内缺血区归巢，协同增加BDNF和VEGF的表达，促进血管生成和神经发生，说明联合治疗不仅可以促进骨髓MSC向缺血脑内的迁移，而且在增强缺血性脑卒中后内源性修复和功能性恢复方面具有协同作用。补阳还五汤具有补气活血通络的功效，该方重用补气药黄芪，并与少量活血药配伍，使气旺血行而治本，祛瘀通络以治标，标本兼顾，是治疗脑卒中后遗症的常用方。研究发现，补阳还五汤通过调控Notch信号通路促进脑缺血/再灌注大鼠NSC移植后的脑保护作用，机制与上调Notch1、Hes1、Hes5的表达有关，可能为移植后的内源性NSC长期保持增殖水平提供保障，弥补移植后快速分化带来的治疗短暂性，从而增加NSC移植对脑缺血/再灌注损伤治疗的持续性, 并发挥更持久的脑保护作用[20]。

2.4 外泌体外泌体是30～100 nm大小的由不同类型的细胞释放的胞外囊泡，包裹着微RNAs (microRNAs，miRNAs)和蛋白质等生物活性物质，在正常和病理条件下均可以跨越血脑和血脑脊液屏障，介导细胞间复杂的信号传递。NVU中的星形胶质细胞、周细胞、小胶质细胞、内皮细胞和神经元均可以释放和摄取外泌体，从而影响脑卒中后NVU的重塑[21]。Xin等[22]研究发现，从转染miR-17-92簇质粒的MSC中获得的富含miR-17-92簇的外泌体在改善MCAO大鼠神经功能、促进缺血边界区少突胶质形成、神经发生和轴突重塑/神经树突可塑性等方面的作用比MSC直接获得的外泌体更显著，促进脑卒中后神经可塑性和功能恢复，可能与通过靶向PTEN蛋白从而激活PI3K/Akt/mTOR/GSK3β信号通路有关。Yang等[23]发现，经过狂犬病毒糖蛋白修饰的携带着miR-124的外泌体可以有效地将miRNA靶向运输到缺血皮层，促进皮质中NPC获得神经元特性和增强皮质神经发生从而改善缺血性损伤。Geng等[24]发现，脂肪干细胞衍生的富含miR-126的外泌体能够通过抑制小胶质细胞活化和炎症反应，增强神经发生和血管再生，从而促进缺血性脑卒中后的功能恢复。

2.5 一氧化氮(NO)调控肝阳偏亢，肝阳化风，气血并行，直冲上犯于脑，可引发缺血性脑卒中，而中药天麻能够平抑肝阳，熄风止痉，祛风通络止痛，被称为“治风之神药”，具有补益作用，能够助文中前面提到的中药川芎活血和熟地补益，常用来治疗缺血性脑卒中。校欢等[25]研究发现，给予天麻中的有效成分天麻素(Gastrodin，GAS)后，可改善双侧颈总动脉夹闭诱导的脑缺血模型小鼠海马CA1区的锥体神经元病理形态学改变，海马DG区BrdU/NeuN阳性细胞数在模型组基础上进一步增加，激活一氧化氮合酶活性，促进NO生成，进一步增加cGMP水平和上调PKG蛋白的表达，表明GAS可能通过激活NO-cGMP-PKG信号通路促进脑缺血后海马神经发生，改善脑缺血后小鼠的认知功能。

3 与神经再生与修复相关的其他研究

利用转分化方法可以直接实现原位改变细胞命运，使转分化生成的细胞补充受损或丢失的神经元以重新塑造神经回路，可避免免疫识别，是促进中枢神经系统神经再生与修复的一种潜在的策略。Qian等[26]利用6-羟基多巴胺诱导黑质神经元丢失和纹状体多巴胺(dopamine，DA)耗竭以建造帕金森小鼠模型，将表达shPTB的腺相关病毒即AAV-shPTB注射到病变侧，发现AAV-shPTB通过敲降PTB而抑制Ptbp1的表达，足以诱导内源性的中脑星形胶质细胞直接原位转化为新的功能性的DA神经元，部分恢复黑质纹状体多巴胺通路中丢失的DA神经元及其轴突，重建黑质纹状体回路并逆转运动障碍。而脑缺血会造成缺血核心区和半暗区带的神经元坏死和凋亡，缺血后梗死核心区周围的胶质细胞如星形胶质细胞、微血管周细胞等可被重新激活分化为神经元[1]，故利用胶质细胞的可塑性促进其向功能性神经元转化将是促进脑缺血后神经再生与修复的一种新策略，应该进一步研究神经胶质细胞分化为神经元的原理和过程，通过转分化或者中药干预等手段诱导和促进这些内源性的胶质细胞增殖并向神经元转换以补充所需要的不同类型的神经元，将是促进脑缺血后神经发生与修复的一个前景。

4 总结

脑缺血损伤后产生的病理环境不利于内源性神经发生与修复，中药可通过促进营养因子的释放、抑制炎症等多种途径来改善微环境，能够抑制细胞凋亡和胶质增生、改善神经元的病理性损伤，促进神经血管单元的恢复等，有助于脑缺血后的神经发生与修复，在此过程中涉及多因素、多个信号通路的调节，但机制复杂尚未完全阐明，仍需进一步研究。各通路之间并非完全孤立，研究通路间的关联可能有助于今后对中药促进脑缺血后神经发生与修复机制的进一步研究。成年脑中内源性神经干细胞的数量和分布部位毕竟有所限制，故仅仅依靠调节内源性神经干细胞对促进脑缺血后神经发生与修复是不足够的，外源性干细胞移植治疗一直是研究热点，但使外源性干细胞植入并增殖分化为成熟细胞的过程是不易控制的，有实验表明外源性干细胞移植加上中药联合治疗具有协同作用，今后可加强外源性干细胞移植结合中药调节内源性神经发生的进一步研究，使二者互补，促进神经干细胞增殖、迁移到受损区域后分化为所需的不同的神经细胞系，整合入现有神经回路之中形成功能性的突触连接，以期能够修复受损神经，促进脑缺血损伤后大脑的神经结构重建与功能再生，相信以干细胞为基础的促进神经发生与修复的不同理念与方法在今后将会得到更加深入的研究。考虑到外泌体有着跨越血脑屏障的优势，本身又能够促进神经发生与修复，故将外泌体作为脑靶向给药的纳米载体加以研究，则有利于发挥药物的神经保护作用。另外，利用胶质细胞的可塑性，通过转分化或者中药干预等手段诱导或促进缺血梗死核心区周围的胶质细胞增殖并向神经元转换以替代受损或死亡的神经元也需要进一步研究。