骨髓染色体制片方法探讨

陈 超 周婷婷 王双阁 路 放 李雨艳

吉林金域医学检验所有限公司，吉林 长春 130000

物种的染色体组型在一定程度上具有该物种的特异性，并可在细胞层面上表现出该物种的进化过程。伴随对染色体研究的不断深入，科学家期望利用先进技术，使染色体内部结构分化染色，以获得更具有特征鉴别功能的信息。骨髓细胞染色体实验室制片方法具体包括秋水仙素处理、收集细胞、低渗处理、预固定、离心、再固定、再离心、制作细胞悬液、滴片、染色干燥、去浮色、镜检等步骤[1]。实验操作较为简单，但影响因素较多，如操作不当将不能获得足够的细胞中期分裂相。因此，本文对实验室骨髓制片方法进行分析，实验操作条件严格控制，对某些易错方法进行改善，以期有效提高实验成功率、提高标本中骨髓细胞中期分裂相。

1 秋水仙素处理

秋水仙素(又名秋水仙碱)，是从百合科植物秋水仙中提取出的一种生物碱，可抑制细胞进行有丝分裂，使染色体形态停留在分裂中期。细胞分裂相的多少、形态等是进行染色体研究的前提，传统活体秋水仙素处理方法需要提前数小时甚至一天对实验动物注射秋水仙素，但通过对制备的标本进行观察发现染色体形态并不理想，难以进行染色体的细致观察；而另一种传统制备方法——血细胞体外培养法虽可获得良好的染色体形态，但是需将血液细胞在体外无菌条件下培养3～5d，周期长，要求条件高[2]。两种方法均有一定局限性，而对骨髓细胞进行体外短时间培养的同时进行秋水仙素处理可简化操作步骤和缩短试验周期，且该方法制作的染色体标本分裂相多、形态良好。具体操作：将收集到的骨髓细胞置于无菌培养液中，并加入秋水仙素(浓度达到10μg/mL)摇匀，封口后37℃培养箱中培养60min。本方法可快速简单的制作出具有较高质量的染色体标本，且可大幅度减少昂贵试剂秋水仙素的用量。传统活体注射法，秋水仙素的用量一般是每克动物体用量5～20μg，而本制备方法只需25μg左右，从而降低了试验成本。并且此方法对于刚刚死亡和濒临死亡的实验动物的染色体制作同样具有重要意义。

2 低渗时间与室温关系

自从徐道觉于1953年提出细胞体外培养与低渗技术以来，检查染色体方法有了巨大进展。低渗可使细胞外的水通过细胞膜的渗透作用进入细胞内，导致细胞膨胀、体积扩大，进而使染色体均匀的分散，细胞膜变薄，保证在滴片时细胞膜易碎，制作出良好的染色体标本，以供镜检。其关键在于把控低渗时间，过短将导致细胞不易破碎；时间过长将导致细胞在滴片前已破碎。时间过短或是过长均得不到良好的制片效果。

以往，国外对低渗的时间和温度要求较为严格，例如在15℃～30℃的情况下，低渗需要20min；在30℃以上需要13～15min。但这个范围波动较大，制片成功率依旧较低。分析其原因是低渗时间不足所致，实验室的温度并不固定，室温可影响器材、样本、试剂的温度，尤其是在北方，温差较大，势必影响进行低渗操作时的实际温度。如在室温15℃和30℃的情况下进行低渗操作，均进行20分钟，前者时间不足，而后者时间多长，均会严重影响制片质量。为了使细胞在低渗过程中充分膨胀，在滴片是获得最佳的染色体分散效果，对不同室温条件下最适低渗时间 进行分析，得出低渗时间与温度的关系符合方程y=-0.4344x+33.99[3]。因此在进行低渗操作时应以实验室温度为基础，计算最佳低渗时间，允许存在误差±2min。

3 固定液比例与固定次数

将经过低渗处理的细胞立即杀死并保持细胞形态的操作称为固定，通过固定可使染色体分散良好、形态清晰。实验室中常用的固定液为冰醋酸∶甲醇=1∶3的溶液。其中冰醋酸具有较强的渗透能力，固定蛋白质作用较强，易使染色体膨胀；而甲醇的作用除固定蛋白质外，还有收缩染色体的作用，所以必须严格控制二者比例，才可保证染色体形状维持原形。且甲醇沸点在65℃左右，发挥较快，而冰醋酸沸点为118℃，发挥最慢。因此在配置固定液时应严格按照比例进行，最好试验前临时进行配置，这样才能保证染色体形态维持正常状态。由于骨髓中含有大量的脂肪组织，可导致制片整体昏暗，严重影响制片质量和阅片工作的正常进行。而反复进行固定2～3次，并更换固定液滴片，可提高制片的透光度，使背景清澈透亮。

4 离心速度与时间

离心可使细胞沉积在试管底部，方便进行提取。但细胞经过低渗、固定等处理后，细胞膜膨胀，比较脆弱，如离心速度过快或时间过长易导致细胞破裂，影响制片效果。因此要个控制离心速度和时间，一般将离心速度控制在1000转/min，时间控制在10min，可得到较好的离心效果[4]。但可根据具体的低渗时间和固定次数进行调整，如低渗时间过长，可试单减慢离心速度，既能保证细胞在离心过程中不会破碎，还能保证细胞完全下沉。既不会丢失染色体，又能保障获得良好的分裂相。

5 冲洗过程

在拨片染色结束后应利用双蒸水经染液洗去。在冲洗过程中水流以缓慢为佳，禁忌直接冲洗细胞所在的位置，避免将染色体冲离玻片。

6 制片过程与环境的关系

染色体分析实验结果与环境有一定关系，气温过低、过高，或是阴雨等天气常常会对实验效果产生负面影响。因此应严格控制实验室环境，使其温度、湿度等保持恒定，可利于染色体标本的制作。

7 结束语

染色体的形态和数目在同一物种内是相对稳定的，通过对其进行分析，可对该物种的遗传指标进行了解。而优良的细胞学标本制作是了解染色体的第一步，因此要不断对实验室制片过程进行规范，以提高制片质量，为后期染色体观察提供便利。