六君子汤相态拆分及表征研究

尚尔雨，马晓乾，于新，孙爽 *，申国涛*

(1.黑龙江省森林保护研究所，黑龙江 哈尔滨 150040；2；黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040)

汤剂是中药中最为悠久的剂型之一，可以适应中医辨证论治的原则，且具备易吸收、疗效快、作用强等特点，在中医的临床应用中也最为普遍[1-3]。中药汤剂是一个复杂的分散体系，其有效成分以溶质或分散相在分散介质中形成真溶液、胶体、混悬液和乳浊液等不同分散相态[4-6]。在多种复方中药汤剂中均观察到直径在几十到几百纳米不等的纳米粒子，药液中的纳米粒子可通过氢键等方式结合难溶性有效成分来增强其难溶性成分的溶解度，从而增强药液的疗效。对于中药复方中纳米相态等分散体系的研究开展于1970年，一方面是由于当时还没普及扫描电子显微镜、原子力显微镜、马尔文纳米粒径仪等表征技术，一方面鉴于当时中药药效物质基础研究还不够深入，导致不能精准获取胶体粒子的形态和溶解参数[7]。例如板蓝根汤剂经过离心除杂后发现其具有明显的丁达尔现象，通过相差显微镜、透射电子显微镜(TEM)等手段观察板蓝根汤剂胶体颗粒的形态特征，发现板蓝根汤剂胶体中存在粒径为60～180 nm大小不等的球形和椭球形的纳米颗粒组分，并且颗粒不稳定会相互聚集成小丘状或粘连成串[8]；通过对当归补血汤主要成分进行分离与表征，在提取液中观察到明显的丁达尔现象，还有粒径在50～100 nm和1 000 nm以上的质点[9-10]。然而，有效成分，尤其是难溶性成分是如何分散到人体中并被人体吸收的，这些都值得我们去深入研究探讨。

六君子汤出自《医学正传》，为四君子汤加陈皮、半夏而成。作为基础方加味治疗脾胃病证，应用非常广泛，如脾胃气虚兼痰湿证、食少便溏、胸脘痞闷、呕逆等。现代临床常用于慢性胃炎、胃及十二指肠溃疡等属脾胃气虚者。试验研究表明六君子汤药理作用广泛，可通过调整细胞因子间的网络平衡，改善胃肠道的内分泌功能，减轻胃黏膜的炎症反应，从而发挥对胃黏膜的保护作用。但由于受条件限制，迄今为止，对六君子汤进行深入的分析和研究很少，其研究仍局限于汤剂药理作用。因此本研究以六君子汤作为研究对象，通过对六君子汤分散体系进行各相态拆分，并对六君子汤中纳米相态进行观察研究，探讨纳米相态与六君子汤补气理气的功效之间的关系。通过研究六君子汤中分散体系的组成，采用透析与超速离心相结合的方法，对六君子汤进行了真溶液相态、纳米相态和沉淀相态拆分，并采用TEM、粒径分析等方法，对其中纳米相态进行了表征，以期为后期研究奠定基础。

1 仪器与试药

1.1 仪器 AB265-S分析天平(瑞士Mettler公司)； H-2050R超速低温离心(湘仪离心机仪器有限公司)；HZS-HA水浴恒温振荡器(哈尔滨市东联电子技术开发有限公司)；JEM-2010HR透射电镜(日本电子株式会社)；Zetasizer Nano-ZS90马尔文粒径仪(英国马尔文仪器有限公司)；I1033透析袋(Biosharp生物科技有限公司)；BJH-W300K电陶瓷锅(广东天际电器股份有限公司)。

1.2 药物与试剂 陈皮、人参、半夏、茯苓、白术、炙甘草，均购于哈尔滨市同仁堂大药房，以上药材经黑龙江中医药大学药学实训教研室吕邵娃教授鉴定为正品，标本存放于黑龙江中医药大学药学院实验室。EDTA (广州市化工试剂有限公司，分析纯)；NaHCO3(天津市天力化学试剂有限公司，分析纯)；试验用水为娃哈哈纯净水，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 透析袋的预处理 用剪刀将透析袋剪成恰当长度约 20 cm。称取0.15 g EDTA在超声作用下溶解于500 mL蒸馏水中，得到1 mmol·L-1EDTA溶液。在超声的作用下，用NaHCO3调节上述溶液到pH=8。将所得溶液液体分为两份各250 mL，用于煮透析袋。将透析袋放置于1 mmol·L-1EDTA-2Na(pH=8)溶液中煮沸 10 min。从 EDTA-2Na 液体中取出透析袋，用蒸馏水洗涤干净。将透析袋再放置于1 mmol·L-1EDTA-2Na(pH=8)溶液中煮沸 10 min。取出，用蒸馏水清洗数次，再将冷却后的透析袋浸没于75%乙醇溶液中，存放于4 ℃冰箱冷藏备用。用前，用蒸馏水充分清洗。

2.1.1 六君子汤的煎煮及预处理 六君子汤(Ⅰ)的煎煮工艺为药材浸泡1.5 h，煎煮2次，每次加10倍量水，每次煎煮60 min，将药液浓缩至生药量为0.55 g·mL-1。将六君子汤经 6 000 r·min-1离心 30 min，得沉淀相态(Ⅱ)，所得样品进行透析-离心处理。

2.1.2 样品透析-超速离心处理 将六君子汤加至透析袋二分之一处，随即将透析袋装入加有200 mL蒸馏水的烧杯中，于水浴恒温振荡器 120 r·min-1震荡30 min，取出透析袋中六君子汤样品；于 10 000 r·min-1离心30 min，取上清液，上述透析-超速离心操作记为1 次，以此重复5次，取上清液样品。烧杯中的液体为真溶液相态(Ⅲ)，透析袋中的液体为纳米相态(Ⅳ)。

2.1.3 样品丁达尔现象观察 将每次透析-离心后的六君子汤样品分别制成原液、5倍稀释液、10倍稀释液3种样品并进行丁达尔现象观察，结果见表1、图1。

表1 透析离心后样品丁达尔现象

图1 透析-离心后样品丁达尔现象

根据以上试验结果看出六君子汤样品稀释10倍丁达尔现象都较为模糊，因此不适合进行下一步试验。而透析-离心1次的5倍稀释液，透析-离心2次的5倍稀释液，透析-离心3次的5倍稀释液，透析-离心4次的原液及5倍稀释液、透析-离心5次的原液这些样品的丁达尔现象较为清晰，可以选取进行TEM观察。

2.1.4 六君子汤纳米相态TEM观察 用滴管吸取少许制备的六君子汤纳米相态滴于支持网(超薄碳膜)上，待干燥后，再滴一次；观察支持网(超薄碳膜)，若无明显物体，再滴一滴样品；TEM 下观察并拍照。

2.2 试验结果

2.2.1 透析-超速离心次数与稀释倍数考察 不同透析-超速离心次数与稀释倍数所得TEM结果见表2、图2。

图2 六君子汤纳米相态不同透析-离心次数与稀释倍数的TEM图

表2 六君子汤样品TEM观察效果

试验结果表明：由于样品中淀粉粒较多，因此影响图像的清晰度，导致图A、B粒子边缘不清晰，仅能观察到模糊的球状物质；图C团聚物边缘不清晰，但是可见明显的球状粒子；图D团状物聚集，粒子清晰可见；图E可以看到团状物聚集，粒子清晰可见；图F只能看到团状物，而且边缘不清晰。由此可知，随着透析-离心次数的增加与样品稀释倍数的增加，样品里的纳米粒更加清晰可见，其中透析-离心4次稀释5倍的样品图像最为清晰，因此选用作为下一步试验。

2.2.2 室温放置时间考察 将于室温放置 0、8、24 h 后的透析-离心4次稀释5倍的六君子汤纳米相态样品，按照上述制片步骤进行制片，进行TEM观察并拍照，结果见表3、图3。

表3 样品放置时间与TEM观察效果

图3 六君子汤纳米相态放置不同时间的TEM图

试验结果表明：图A圆球状粒子清晰，可见粒子外面包裹的保护层，粒子内的物质可清晰看清，图像效果好；图B可见连续的葡萄状粒子，粒子外面包裹的保护层与粒子内的物质虽然能看清，但较图A模糊；图C可见团状物，团状物内可见粒子，但是粒子较为模糊，粒子聚集。因此表明样品室温下放置0 h，TEM图像最为清晰。

2.2.3 最优方案的六君子汤纳米相态TEM观察 TEM下观察结果表明，六君子汤样品中存在纳米颗粒，结果见图4。

图4 六君子汤纳米相态TEM图

2.2.4 六君子汤纳米相态的粒径分布及其电位大小 利用马尔文粒径仪对六君子汤纳米相态的粒径大小及其分布进行测定。在室温条件下，取适量的六君子汤纳米相态溶液，加入粒径仪的样品管中进行分析。试验结果表明，粒径主要集中在100 nm，此外，还存在少量粒径大于100 nm的粒子。上述结果与TEM结果相互吻合，结果见图5A。

利用马尔文粒径仪对六君子汤纳米体系进行电位测定。在室温条件下，取适量的六君子汤纳米相态溶液，置于粒径仪的微电泳池中进行分析，并记录数据。试验结果表明，六君子汤纳米相态的电位为-2.22～-1.97 mV，说明体系不稳定，这可能是由于体系中出现不同程度的团聚造成的，结果见图5B。

A.粒径强度分布图；B.Zeta电位分布图图5 六君子汤纳米相态的表征

3 讨论

前期文献研究表明，使用超薄碳膜作为支持网、透析袋作为拆分介质，有利于中药汤剂中纳米相态的拆分。因此，本试验在以上两个方法的基础上，利用丁达尔现象初步判断六君子汤中是否存在纳米相态，并对样品透析-离心次数、稀释倍数以及样品放置时间进行了考察。本试验通过对六君子汤中的相态拆分进行分离与表征，从六君子汤中发现了纳米粒，并以分离的纳米粒子的形态为评价指标，对透析-超速离心次数(1 次、2 次、3 次、4 次及 5 次)，样品稀释倍数(0倍、5倍、10倍)，样品溶液室温放置时间 (0、8、24 h)等方面进行考察，优化了拆分工艺，最终确定透析与超速离心4次，样品稀释5倍，室温放置0 h的拆分工艺。按照最佳拆分工艺制备六君子汤纳米相态3批，考察各批次六君子汤纳米相态及TEM形态。结果表明，纳米相态中存在纳米颗粒，TEM图像清晰可见球状团聚物，图像良好，说明该拆分工艺的重现性良好，工艺可行。

有研究报道，中草药水煎液中存在纳米聚集体，尽管它们的药理学性质和生成机理仍然是未知的，但是纳米聚集体的存在提示我们中药汤剂可能是通过纳米相态来实现增溶。从六君子汤配伍增效角度来看，难溶性成分(人参中的人参皂苷、茯苓中的茯苓酸、陈皮中的黄酮)的溶出度增大，推测白术和甘草中的植物性多糖、根茎成分中所含的无机物质、甘草中的甘草酸(表面活性物质)在整个汤剂的形成过程中，应该各自扮演着不同的角色，从而形成了一种天然的纳米相态。但是该体系的存在及机制尚不明确，推测六君子汤中纳米相态的大分子物质形成核-壳结构，于TEM图中观察到类似结构，有待于今后科研工作的进一步证实。