UHPLC法同时测定铁苋菜中4种成分含量

马琦峰，刘威，夏林波，邓仕任

(辽宁中医药大学药学院，辽宁 大连 116600)

铁苋菜(AcalyphaaustralisL.)为大载科铁苋菜属一年生草本，又称海蚌含珠，我国大部分省区均有分布，有止泻、止血、除湿、解毒之功效，是止泻药苋菜黄连素胶囊的主要成分[1]。现代研究表明，铁苋菜中主要含有有机酸、黄酮、萜类、生物碱等多种成分，而原儿茶酸、没食子酸、没食子酸甲酯等有机酸类和芦丁等黄酮类物质是其发挥抗菌、抗炎、止血等药理作用活性成分。目前对于铁苋菜的研究及含量测定的报道并不多见[2-4]，这对铁苋菜的质量控制是不利的。本论文收集了10批次辽宁地区野生铁苋菜药材，并构建了一种基于超高效液相色谱(UHPLC)法的铁苋菜中4种活性成分的含量测定方法，该方法的建立将有助于铁苋菜的全面质量控制[5-10]。

1 试验材料

1.1 试验药品 没食子酸、原儿茶酸、没食子酸甲酯、芦丁等4种标准品，均购自四川省维克奇生物科技有限公司，纯度均大于98%。乙腈为色谱纯(Tedia，美国)；水为超纯水，其余试剂均为分析纯。10批次铁苋菜药材经辽宁中医药大学张建奎副教授鉴定，均为大戟科植物铁苋菜(AcalyphaaustralisL.)的干燥全草，具体信息见表1。

表1 样品信息

1.2 试验仪器 Agilent 1290 Infinity液相色谱系统(安捷伦科技有限公司)；Poroshell 120 SB-C18(3.0 mm×150 mm，2.7 μm，安捷伦科技有限公司)；AL204型电子天平(梅特勒托利多公司)；KQ2200型超声清洗器(昆山市超声波仪器有限公司)；Milli-Q Academic超纯水仪(密理博公司)。

2 试验方法与结果

2.1 色谱条件 A相为0.1%甲酸-水，B相为0.1%甲酸-乙腈。梯度洗脱条件为0～3 min，B:5%→10%；3～5 min，B:10%→25%；5～10 min，B:25%→30%。柱温：40 ℃，流速：0.6 mL·min-1，检测波长为265 nm。

2.2 供试品溶液制备 取1号铁苋菜药材，粉碎后过三号筛，精密称定约1 g，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇20 mL，称定重量，冷浸1 h后，超声提取(功率80 W，频率40 kHz)50 min，放冷，甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过即得。

2.3 对照品溶液制备 精密称取没食子酸、原儿茶酸、没食子酸甲酯、芦丁等4种标准品适量，甲醇溶解制成每1 mL分别含没食子酸0.040 mg、原儿茶酸0.10 mg、没食子酸甲酯0.32 mg和芦丁0.09 mg的混合对照品溶液。

2.4 线性关系考察 精密吸取混合对照品溶液0.5、1、1.5、2、3、4、5 μL，分别注入液相色谱仪，在“2.1”项下色谱条件进行分析。以峰面积Y对绝进样量X(μg)绘制标准曲线，回归方程见表2。

表2 线性关系考察结果

2.5 重复性试验 取1号铁苋菜药材共6份，分别制成6份样品溶液。将各样品溶液依次检测，记录各次峰面积并计算药材中没食子酸、原儿茶酸、没食子酸甲酯、芦丁等4种成分的含量分别为0.37、1.01、3.25、0.86 mg·g-1，RSD分别为0.90%、2.20%、1.53%、1.48%，结果显示重复性符合含测要求。

2.6 精密度试验 取“2.3”项下混合对照品3 μL，重复进样6次，没食子酸、原儿茶酸、没食子酸甲酯、芦丁等4种成分的峰积分面积平均值分别为228.7、556.6、1 512.9、659.4，RSD分别为0.43%、1.21%、2.68%、2.02%，表明仪器具有良好的精密度。

2.7 稳定性试验 取同一份供试品溶液(1号样品)，室温条件下密封放置0、4、16、24、32、36 h后，分别进行含量测定，计算各次样品中没食子酸、原儿茶酸、没食子酸甲酯、芦丁等4种成分的峰面积RSD分别为1.36%、1.10%、0.88%、1.74%，表明样品溶液能稳定36 h。

2.8 加样回收率试验 取已知含量的铁苋菜(1号样品)6份，每份约1 g，精密称定。置具塞锥形瓶中，每组精密加入适量混合对照品溶液，再按“2.2”项下方法制备供试品溶液，在上述色谱条件下进行分析，结果见表3。

表3 加样回收率试验(n=6)

2.9 实际样品测定 分别称取10个批次的铁苋菜药材粉末各约1 g，分别按“2.2”项下方法制备供试品溶液，进样量3 μL进行色谱分析，采用外标法以峰面积计算每个样品中4种成分的含量，结果见图1、表4所示。

A.铁苋菜供试品；B.混合对照品 1.没食子酸；2.原儿茶酸；3.没食子酸甲酯；4.芦丁图1 UHPLC色谱图

表4 含量测定结果(mg·g-1 ,n=3)

3 讨论

3.1 铁苋菜中化学成分含量测定的讨论 铁苋菜中化学成分含量测定报道较少，多以没食子酸含量为检测标准，且分析时间一般较长，不利于多成分的快速分析。本文建立了基于UHPLC法的铁苋菜多成分快速分析方法，可在10 min内测定4种酚酸和黄酮类成分的含量，可为铁苋菜药材的质量评价提供科学依据。

3.2 供试品制备方法的讨论 根据铁苋菜中酚酸和黄酮类化合物的相关性质，考察了回流提取法和超声提取法这两种提取方法，结果显示了这两种提取方法无显著性差异，因此选择操作更加简便的超声提取法。起初以乙醇作为提取溶剂，结果显示用该提取液峰较少，峰形较差。之后用甲醇作为提取溶剂，得到的色谱峰较多，能匹配出本试验所测的4种成分，且峰形较好，因此选择甲醇作为提取溶剂，且甲醇浓度越大，提取效率越高。

3.3 色谱条件的优化讨论 通过检测器全波长扫描，在波长265 nm处4个成分呈现较好的吸收峰。分别考察了甲醇-水、甲酸-水、乙腈-水、甲酸-乙腈等流动相系统，结果显示以甲酸-水和甲酸-乙腈所配成的混合流动相系统，得到的峰形较对称，采用等度洗脱，无法得到较好的分离度，因此采用梯度洗脱，经过多次试验，决定随着时间的延长来按一定程序增大甲酸-乙腈在混合流动相系统中的比例，使流动相的极性梯度下降，从而使被分离的物质按顺序流出，且在较短的时间内呈现出较好的分离度，从而达到含量测定的要求。

3.4 采收地点对本品含量的影响 由含量测定结果可知，3个采集地的野生铁苋菜药材有明显的相似性，均以没食子酸甲酯的含量为最高，而没食子酸含量最低。但同时，不同产地的药材也体现出了明显的差异性。本溪产样品中，没食子酸和没食子酸甲酯的含量较其他产地高，但芦丁含量偏低；丹东产样品，则是芦丁含量较高，而原儿茶酸含量偏低；鞍山产样品，各成分含量比较平均。上述差异也可为铁苋菜药材的产地区分提供借鉴的思路。