莼菜叶片对高温/低温胁迫的响应

陈银花 覃章辉 沈永琴 钟克 王明红

莼菜（Brasenia schreberiJ.F.Gmel.），是莼菜科（Cabombaceae）莼属（Brasenia）多年水生草本植物[1]，是药食两用的珍稀水生蔬菜，已被中国列入国家Ⅰ级重点保护野生植物名录[1，2]。目前对莼菜的研究主要在栽培管理技术[3，4]、莼 菜 多 糖 提 取[5～7]、莼菜群落[8]和品种资源遗传多样性[9]等几个方面，关于不同生态型莼菜植株对环境因子的生理响应研究较少。

植物都有较适生长温度范围，超出这个范围，会发生温度胁迫（高温、低温），造成生长不良或死亡。持续高温或低温胁迫会破坏植物细胞膜结构，使植物体内产生过量的活性氧物质，丙二醛（MDA）含量增加，严重影响植株正常的生长和发育[10，11]。有研究表明，植物在高、低温胁迫下叶片内可溶性蛋白含量显著增加，以减轻逆境伤害[12]；可溶性蛋白质总量与各品系对高温的耐性呈正相关，耐性强的品系含量高[13]。此外，高温或低温胁迫会诱导超氧化物歧酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）等保护酶活性发生变化，活性变化幅度与植物抗逆性密切相关[14，15]。 保护酶活性及MDA含量可作为植物受到温度胁迫程度和植物对温度胁迫抵御能力的衡量指标[16]。前期研究结果表明，莼菜有夏季休眠期和冬季休眠期[17]，休眠时间长。因此，研究温度胁迫对不同生态型莼菜植株叶片的生理影响，为筛选抗寒或耐热莼菜品种和打破莼菜休眠提供理论依据，对莼菜种质资源的保护以及产业发展具有指导意义。

图1 3类莼菜叶片样品

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验所用莼菜叶片于2018年11月10日（莼菜休眠期）采自湖北利川继昌莼菜基地（30°10'5''N，108°48'22''E；海拔1 100 m左右）。材料来自同一试验田地，已连作5 a，以每年冬季莼菜烂叶作为自给肥料。样品包括2种生态型：冬季休眠生态型（DL和WB）和冬季非休眠生态型（ND）。DL是莼菜植株功能叶，随冬季温度的持续降低将全部腐烂坏死；WB是莼菜植株在越冬过程中形成的休眠芽叶片，在持续低温环境下叶片仍然长势良好；ND是顶端卷曲小叶能正常展开、功能叶长势良好，并且冬季不会进入休眠的莼菜植株叶片。3类叶片，如图1所示。

1.2 试验设计

采取长势基本一致且都带有完整健康浮叶的莼菜植株，先用纯水将其附带的杂质清洗干净，再用种植盆（外口径21 cm，高12 cm）以水培的形式培养，置于LRH-250-G型光照培养箱（每天12 h光照/12 h黑暗交替，PPFD=121 μmol·m-2·s-1）中，分别进行低温（5°C）和高温（35°C）处理，每组处理设3次重复，每个重复15株，以0、2、4、6 d为取样时间点，每个温度同一时间点取3株幼苗，每株取长势相对一致的功能叶片测定其生理生化指标。

1.3 指标测定

可溶性蛋白提取参照宋松泉等[18]的方法，用考马斯亮蓝法测定[19]；丙二醛（MDA）含量采用硫代巴比妥酸（TBA）比色法测定[20]；抗坏血酸过氧化物酶（APX）活性测定参照宋松泉等[18]的方法；过氧化氢酶（CAT）活性测定参照孙兵[21]、孙祥生[22]的方法；过氧化物歧化酶（SOD）活性测定参照孙兵[21]、Rao等[23]的方法；过氧化物酶（POD）活性测定使用愈创木酚法[21]；多酚氧化酶（PPO）活性测定使用邻苯二酚法[21]。

1.4 数据分析

文中所有数值均表示为：平均值±标准误。试验数据用Excel 2010和SPSS 22.0软件进行统计和分析，用one-way ANOVA进行单因素方差分析和Student-Newman-Keuls检测进行多重比较（P=0.05）。

2 结果与分析

2.1 高温胁迫对莼菜休眠和非休眠生态型叶片生理指标的影响

①可溶性蛋白含量的变化 随高温胁迫时间延长，休眠生态型植株体内可溶性蛋白含量呈现不同的变化趋势，DL体内可溶性蛋白质含量呈显著下降的趋势，叶片在第5天全部腐烂，WB的可溶性蛋白含量则呈现先降后升的变化趋势（P＜0.05）；非休眠生态型植株（ND）在高温胁迫下呈先降后升的变化趋势（P＜0.05，表1）。

②MDA含量的变化 高温胁迫下DL的MDA含量显著高于ND和WB。其随胁迫时间的延长，休眠生态型植株（DL和WB）的MDA含量呈现先降后升的变化趋势（P＜0.05），非休眠生态型植株的ND的MDA含量则呈现“降—升—降”的变化趋势（P＜0.05，表2）。

③高温胁迫对莼菜休眠和非休眠生态型叶片SOD、POD、CAT、APX和PPO活性的影响 高温胁迫下，随时间的延长，DL、ND和WB的SOD活性均呈显著下降的变化趋势（P＜0.05），但DL的SOD活性远高于ND和WB；DL的POD活性随高温胁迫时间的延长呈先降后升的变化趋势（DL在第5天全部腐烂），WB和ND的POD活性呈现“降—升—降”的变化趋势（P＜0.05）；DL的CAT活性随胁迫时间的延长呈显著上升的变化趋势（DL在第5天全部腐烂，P＜0.05），WB的CAT活性在高温下胁迫2 d时呈显著下降（P＜0.05），随后随胁迫时间延长显著上升（P＜0.05），ND的CAT活性则无显著性变化（P＞0.05）；DL和WB的APX活性随高温胁迫时间延长无显著性差异（P＞0.05），而ND的APX活性呈显著上升变化趋势（P＜0.05）；DL和ND的PPO活性呈显著上升的变化趋势（P＜0.05），WB的PPO活性则无显著性变化（P＞0.05，表3）。

表1 高温胁迫下莼菜休眠和非休眠生态型叶片可溶性蛋白含量（mg/g）随培养时间的变化

表2 高温胁迫下莼菜休眠和非休眠生态型叶片MDA含量（nmol/mg）随培养时间的变化

2.2 低温胁迫对莼菜休眠和非休眠生态型叶片生理指标的影响

①可溶性蛋白含量的变化 低温胁迫下，3种莼菜叶片的可溶性蛋白含量随胁迫时间延长整体呈上升趋势，其中冬季休眠生态型植株（WB）的可溶性蛋白含量呈显著上升的变化趋势（P＜0.05，表4）。

②MDA含量的变化 在低温（5℃）下，随胁迫时间的延长，冬季休眠生态型植株（DL）的MDA含量呈显著下降趋势（P＜0.05），且均显著高于ND和WB的MDA含量。而ND和WB的MDA含量并无显著性变化（P＞0.05，表5）。

③低温胁迫对莼菜休眠和非休眠生态型叶片SOD、POD、CAT、APX和PPO活性的影响 随低温胁迫时间的延长，DL的SOD活性呈现先降后升的变化趋势（P＜0.05），ND的SOD活 性 呈 持 续 下 降的变化趋势（P＜0.05），而WB的SOD活性则无显著性变化（P＞0.05）；ND和WB的POD活性在低温胁迫2 d时均显著增加，随后显著下降（P＜0.05），DL的POD活性则与之相反，呈先降后升的变化趋势（P＜0.05）；DL、WB和ND的CAT活性均呈显著上升变化趋势（P＜0.05）；DL和WB的APX活性呈现先升后降的变化趋势（P＜0.05），ND的APX活性则呈显著上升的变化趋势（P＜0.05）；ND的PPO活性呈先升后降的变化趋势（P＜0.05），而DL和WB的PPO活性则无显著性变化（P＞0.05，表6）。

表3 高温胁迫下休眠和非休眠生态型叶片SOD、POD、CAT、APX和PPO活性随培养时间的变化

3 讨论与结论

植物对逆境的响应与其体内可溶性蛋白含量的变化存在相关性[24]，植物体内可溶性蛋白含量的积累可作为植物渗透调节物质和防脱水剂而有利于植物抗寒[25]。本研究中，非休眠生态型植株（ND）和休眠生态型植株（DL、WB）在低温胁迫下，随胁迫时间延长，其蛋白质含量整体呈上升趋势；高温胁迫下，DL的可溶性蛋白含量随胁迫时间的增加呈显著下降的趋势，这可能是由于温度过高阻碍了DL植株叶片蛋白质的正常合成，而且植株自身为抵抗逆境其蛋白质会降解，植物自身保护酶系统也会消耗，导致蛋白含量降低。这是DL叶片在高温胁迫5 d后全部腐烂，而ND和WB植株叶片仍然长势较好的原因。

表4 低温胁迫下莼菜休眠和非休眠生态型叶片可溶性蛋白含量（mg/g）随培养时间的变化

表5 低温胁迫下莼菜休眠和非休眠生态型叶片MDA含量（nmol/mg）随培养时间的变化

MDA含量是反映植物细胞受伤害程度以及对逆境的响应[26]，耐性强的品种MDA含量较低[27]。植物利用抗氧化酶加强抗氧化作用抑制活性氧的积累，防止自由基的毒害，提高抗性，随着逆境胁迫的增加，酶活性一般呈上升趋势，或者呈先上升后下降的趋势[28，29]。本研究中，随低温胁迫时间的延长，DL中的CAT活性显著上升，MDA含量显著下降，SOD和POD活性在胁迫2 d后也显著增加，这说明SOD、POD和CAT能在一定程度上清除了DL中因温度胁迫产生的过量活性氧物质，减轻植物的膜脂过氧化伤害；而莼菜叶片中APX活性一直较低，并无明显相关性，这可能是由于APX在DL受低温胁迫期间只是起着信号传导作用。综合分析可知，ND和WB较DL有较强的低温耐性，ND和WB或为莼菜冬季复壮的理想材料。

高温胁迫下，随胁迫时间延长，DL、ND和WB中的SOD、POD活性最终呈下降趋势；DL的CAT活性在高温胁迫前期显著增加，2 d后其活性并无显著性变化，这说明对高温胁迫最先做出响应的是SOD。此时莼菜休眠生态型植株叶片（DL）中MDA含量呈现先缓慢降低随后升高的趋势，均高于ND和WB 2种生态型植株叶片，这又说明高温胁迫下DL内MDA含量随胁迫时间延长而增加与保护酶活性的降低有关。然而随高温胁迫时间的延长，ND的CAT活性无显著性变化，其PPO活性呈显著上升的变化趋势，这似乎表明ND在高温胁迫中，通过PPO来抑制体内的活性氧物质，从而对高温具有一定的耐性，这与Siddika等[30]的研究结果相似。

表6 低温胁迫下休眠和非休眠生态型叶片SOD、POD、CAT、APX和PPO活性随培养时间的变化

综上推测，非休眠生态型植株（ND）和冬季休眠生态型的冬芽（WB）对低温和高温均具有较强的耐性，或可作为莼菜复壮的理想材料。