两种全自动免疫分析系统检测25-羟基维生素D的一致性评价

龚美亮，陈 瑞，李晓霞，王科宇，周 玉，邓新立，丛玉隆

解放军总医院第二医学中心 检验科，北京 100853

维生素D的功能是参与调节体内钙磷代谢、维持骨骼健康，其缺乏可能导致佝偻病、软骨病、骨质疏松，增加老年人骨折和跌倒的风险[1]。近年来大量流行病学研究表明，维生素D缺乏或不足与癌症、感染性疾病、自身免疫性疾病及心血管疾病的发生紧密相关[2-4]，甚至与高死亡风险相关[5]。维生素D缺乏在世界大多数地区较为常见，是一个全球关注的问题[6-8]。随着人们对于维生素D重要性的认识逐渐加深，维生素D的检测需求也逐年增加[6-7]。自动化免疫分析法由于其自动化水平高、人员要求低、高通量等优点，成为临床检测25-羟基维生素D[25(OH)D]的主流设备，完成了90%的常规检测[9]。新产业全自动免疫分析系统是国内唯一通过美国CDC维生素D标准化认证计划(2018年)的维生素D检测设备[10]，目前在国内临床实验室广泛应用于25(OH)D检测，然而关于新产业检测25(OH)D的评价文献较少。索灵全自动免疫分析系统是世界范围内使用最为广泛的25(OH)D检测设备之一，根据国际性维生素D室间质量评价计划(Vitamin D External Quality Assessment Scheme，DEQAS)的 报 告，2018年参加质量评价计划的免疫法设备中索灵设备约占1/3[11]。禹松林等[12]对国内人群的研究也表明5种自动免疫分析设备中索灵与比对方法具有更好的相关性。因此本研究选择索灵作为比对方法，将新产业与其进行检测25(OH)D的一致性评价，以期为临床正确评价和应用新产业检测结果提供依据。

材料与方法

1 仪器与试剂 新产业全自动化学发光免疫分析仪Maglumi 4000 Plus(中国，新产业生物医学工程股份有限公司)，索灵电化学发光免疫分析仪LIAISON XL(意大利，索灵公司)。25(OH)D检测试剂盒及定标品、质控品均为相应厂家原装试剂。

2 样本来源 解放军总医院第二医学中心2019年5 - 6月810例健康查体者血清，其中男性779例，女性31例，平均年龄(73.58±10.78)岁。每例查体者的血清于体检当日分装2小份于EP管，冻存于-80 ℃冰箱。

3 25(OH)D检测 冻存标本于检测当天溶解，在校准、质控结果良好的情况下检测，所有检测在2 d内完成。以世界范围内广泛使用的索灵免疫法做为比对方法，与新产业检测结果进行比对。索灵在2017 - 2018年DEQAS中表现较好，40例样本的索灵检测结果(约200家实验室均值)与参考测量程序确定的靶值一致性很好。见图1。

图1 2017 - 2018年DEQAS：40例样本索灵与靶值的Passingbablok回归分析Fig.1 Passing-bablok regression of DiaSorin with target values for 40 samples from 2017 to 2018 by DEQAS

4 维生素D营养状况临床判定 根据国家卫健委卫生行业标准：≥ 20 ng/mL为维生素D充足，≥ 12且＜20 ng/mL为维生素D不足，＜12 ng/mL为维生素D缺乏[13]。

5 统计学分析 数据分析及作图采用SPSS19.0、MedCalc 9.2.1.0及GraphPad Prism 8.0完成。配对符号秩和检验分析两种方法检测结果的统计学差异。根据索灵检测25(OH)D浓度分组，趋势检验(多项式对比法)分析新产业检测偏差随25(OH)D浓度增长的变化趋势。Passing-bablok回归、组内相关系数(intra-class correlation coefficient，ICC)分析两种检验方法的相关性、一致性。Kappa分析比较两种方法用于临床评估维生素D营养状况的一致性。P＜0.05为差异具有统计学意义。

结 果

1 两种方法25(OH)D检测值比较 检测810例样本25(OH)D的浓度范围，索灵为17.60(4.00 ～62.30) ng/mL，新产业为16.35(7.36 ～ 66.50) ng/mL。新产业的检测结果与索灵有统计学差异(P＜0.001)，二者的平均偏差为-1.39 ng/mL(-1.06%)。见表1。

表1 新产业与索灵检测25(OH)D结果(ng/mL, n=810)Tab.1 25(OH)D results from DiaSorin and Snibe(ng/mL, n=810)

2 检测偏差与25(OH)D浓度的关系 将所有样本根据索灵检测25(OH)D浓度分为0～10 ng/mL(n=73)、10～15 ng/mL (n=206)、15～20 ng/mL(n=229)、20～25 ng/mL (n=161)、25～30 ng/mL(n=85)、＞30 ng/mL (n=56)。从低浓度组到高浓度组，新产业与索灵的平均偏差分别为51.36%、9.00%、-6.47%、-13.61%、-18.60%、-21.57%。在25(OH)D浓度＞10 ng/mL的各组中，偏差随浓度变化的趋势检验Ptrend=0.000，说明随着25(OH)D浓度增加，新产业的检测偏差有增加的趋势，表现出浓度依赖性(图2)。

图2 新产业检测25(OH)D与索灵偏差表现出浓度依赖性Fig.2 Measurement deviation of Snibe and DiaSorin showed a concentration dependence

3 检验方法的相关性和一致性 新产业与索灵有较好的相关性，Spearman秩相关系数r=0.806(95% CI：0.780～0.829；r＞0.6为可接受，r＞0.8为优秀)，ICC=0.766(95% CI：0.700～0.814；ICC＜0.4为一致性较差，ICC＞0.75为一致性较好[14])。新产业与索灵的Passing-bablok回归方程斜 率 为0.650(95%CI：0.623～0.680)，截 距为4.871 (95% CI：4.396～5.338)(图3)。

图3 新产业检测25(OH)D与索灵的Passing-bablok回归分析Fig.3 Passing-bablok regression of Snibe with DiaSorin for 25(OH)D measurement

4 维生素D营养状况判定 新产业判断维生素D充足(≥ 20 ng/mL)、不足(≥ 12～＜20 ng/mL)、缺乏(＜12 ng/mL)与索灵的符合率为68.77%。新产业判断维生素D充足、不足、缺乏与索灵的一致性度量Kappa值为0.479(表2)(Kappa ＞0.4为可接受，＞0.75为优秀[15])。根据二者回归方程将新产业的结果进行转换之后，新产业判断维生素D营养状况与索灵的符合率为82.96%，Kappa值为0.717(表3)。

表2 新产业判断维生素D充足、缺乏或不足与索灵的一致性(n)Tab.2 Consistency of Snibe and DiaSorin on clinical judgment (n)

表3 转换后新产业判断维生素D充足、缺乏或不足与索灵的一致性(n)Tab.3 Consistency of Snibe (after conversion) and DiaSorin on clinical judgment (n)

讨 论

全自动免疫分析设备具有高通量、节省人力等特点，适合我国大中型医院的工作量。在质谱法检测维生素D于自动化和高通量等方面取得大的进展之前，自动免疫法在临床检测25(OH)D领域还将占据重要的地位。然而免疫法也存在着维生素D其他代谢产物干扰、抗体特异性不一、不能区分25(OH)D3与25(OH)D2等缺陷，不同免疫法的结果往往不可比，其检测标准化一直是维生素D检测的难题[16-17]。新产业是通过美国CDC和FDA认证的25(OH)D检测平台，目前国内外对其评价研究较少。本研究选择世界范围内广泛使用的索灵自动免疫分析系统作为参考方法，将新产业与其进行检测25(OH)D的一致性评价。

虽然新产业的检测结果与索灵总平均偏差较小[-1.39 ng/mL(-1.06%)]，但在25(OH)D＜10 ng/mL(n=73)的样本中，其检测偏差高达51.36%。邹迎曙等[18]报道新产业对低值人血清样本(8.99 ng/mL)的检测偏差为64.2%，与本研究基本一致。低25(OH)D水平时，新产业检测偏差较大的原因可能是由于其检测线性范围(10～150 ng/mL)造成。文献[18]还报道标准品靶值分别为18.89 ng/mL、29.32 ng/mL、32.70 ng/mL时新产业检测偏差分别为-9.9%、-14.6%、-29.2%，与本研究的对应的浓度范围平均偏差-6.47%、-18.60%、-21.57%基本吻合。本研究中，在25(OH)D浓度＞10 ng/mL的浓度范围内，新产业与索灵的检测偏差随着25(OH)D浓度的增加而增加，表现出浓度依赖性(图2)。一些免疫法检测25(OH)D出现浓度依赖性偏差在DEQAS的报告中也被描述过[11]，但还需要更多的研究加以证明。

尽管两种方法存在检测偏差，通过回归方程和ICC可以判断新产业与索灵检测结果仍表现出较好的相关性和一致性。在此基础上，可以尝试利用二者的回归方程对新产业的检测结果进行转换，从而降低二者的偏差、减少维生素D营养水平归类错误。转换前新产业判维生素D充足、不足、缺乏与索灵的符合率与Kappa值分别为68.77%和0.479；转换之后新产业判维生素D充足、不足、缺乏与索灵的符合率与Kappa值分别为82.96%和0.717。经过回归方程转换后，新产业与索灵判断维生素D营养状况的符合率及Kappa值都有较明显的提高，这也为解决不同免疫法结果差异的问题提供了一种解决思路。

免疫法检测维生素D的准确性受到诸多因素的影响，国内外研究报道不同免疫法结果多不可比，而不同实验室使用同一个参考范围的现状也给维生素D的结果判读带了混乱。由于不同免疫法的检测结果存在偏差，临床实验室应注意建立针对本实验室方法的参考区间，以免引起临床判读维生素D营养状况错误。另外，本研究发现利用与可信的比对方法的回归方程对检测结果进行转化可能是也是一个比较可行的解决方法。

利益冲突：所有作者均披露无利益冲突。本研究获得索灵诊断医疗设备(上海)有限公司和中国新产业生物医学工程股份有限公司对试剂和仪器设备等的支持，但研究结果与公司无关。